Закон «джунглей». В поисках формулы жизни Кэрролл Шон
Лемминги оказались не единственной дичью, численность которой так сильно колебалась. Элтон обнаружил, что популяции канадского кролика (или американского беляка) изменяются таким же образом: резкие всплески численности примерно раз в 10 лет, а затем такие же резкие падения. Кролики – любимое лакомство канадской рыси. «Она живет кроликами, рыщет за кроликами, думает о кроликах, напоминает кролика на вкус, умножается вместе с кроликами, а когда их нет – гибнет от голода в обескроленных лесах», – писал один натуралист. При этом мех канадской рыси – излюбленная добыча трапперов из компании Hudson Bay. Оказалось, что компания вела тщательный учет количества шкур, заготовленных во все годы, начиная примерно с 1821-го. На графике эти цифры также выстраивались в явственные 10-летние циклы, коррелировавшие с увеличением численности кроликов (рис. 2.4).
Элтон считал такие циклы ценными свидетельствами о наличии механизмов, которым подчиняются сообщества животных. Они демонстрировали то, насколько сильно может увеличиться популяция, особенно если такой рост будет неконтролируемым. Аналогично, резкие спады численности леммингов и кроликов демонстрировали, что есть и такие силы (скажем, эпидемии), которые могут резко сократить число животных. Эти циклы также показывали, как численность одних животных может влиять на численность других животных в рамках пищевой цепи.
Рис. 2.4
Десятилетние циклы колебания численности рыси и кролика на севере Канады. Элтон изучил архивы компании Hudson Bay, определив таким образом, что всплески и спады численности рыси и кролика повторяются с десятилетней периодичностью
Из Elton, 1924
Одним словом, циклы показывали, что численность животных зависит от многих факторов. Элтон изложил эти «Периодические флуктуации численности животных» в своей 45-страничной работе 1924 г. Он еще не знал, что тем самым закладывает краеугольный камень новой науки – экологии. Далее молодой естествоиспытатель стал строить ее фундамент.
Что наша жизнь?! – еда
В 1926 г. Джулиан Хаксли, бывший научный руководитель Элтона, подготовил серию коротких книг по биологии. Он стремился, чтобы все эти книги были написаны ведущими учеными и каждый рассказал бы о новых или формирующихся принципах. Хотя Элтону было всего 26, Хаксли высоко ценил его богатый опыт арктических исследований (на тот момент – уже три экспедиции) и восхищался оригинальностью мысли, свойственной его работам. Хаксли предложил Элтону написать короткую книгу об экологии животных, и Элтон согласился.
Элтон с головой ушел в эту работу. Он работал как проклятый почти каждую ночь с десяти вечера до часу ночи у себя в квартире близ музея Оксфордского университета и написал книгу менее чем за три месяца! Несмотря на бешеный темп подготовки, получившаяся работа «Экология животных» стала классической как в стилистическом, так и в содержательном плане. Эта 200-страничная книга написана увлекательно и живо, полна удачных аналогий. Ее главы логически выстроены вокруг ключевых идей, позволяющих читателю познакомиться с, так сказать, повесткой новой экологической науки, а также с теми ее аспектами, которые Элтон считал наиболее важными.
Элтон объяснял, что «одну из основных тем книги можно охарактеризовать как социологию и экономику животных». Он намеренно проводил аналогию с реалиями человеческого общества – экономикой и социологией. «Очевидно, что животные образуют сложное сообщество, не менее сложное и интересное, чем человеческое», которое «подчиняется экономическим законам», – писал Элтон. Эта аналогия имела глубокие корни в биологии. Концепцию «экономики природы» в XVIII в. разделял великий естествоиспытатель Карл Линней, а в XIX в. – Дарвин. Ее смысл заключался в том, что сообщества животных, как и человеческий социум, состоят из взаимодействующих существ, каждое из которых обладает своим местом и ролью.
«На первый взгляд попытка отыскать какие-либо общие принципы сообществ животных может показаться безнадежной, – писал Элтон. – Но внимательное изучение простых сообществ… (которым он и занимался в Арктике) демонстрирует, что действительно существуют некоторые принципы, позволяющие анализировать сообщество животных по частям, и в свете этих принципов мнимая сложность исчезает».
В основе упомянутых принципов лежала важнейшая роль, которую Элтон уделял пище и пищевым цепям. Он считал пищу «валютой» в экономике животных. «Основным движущим стимулом для всех животных является необходимость найти подходящую пищу в достаточном количестве. Пропитание – животрепещущий вопрос в сообществе животных, вся структура и деятельность этого сообщества зависят от проблемы пропитания», – утверждал ученый.
Все принципы, следовавшие из этой базовой посылки, Элтон сформулировал в виде очаровательных и удачно подобранных китайских пословиц:
Пищевые цепи
Большая рыба ест малую; малая ест водяных жучков; водяные жучки едят водоросли и ил.
Пищевые цепи образуют «экономические» связи между различными членами сообщества. Цепи животных связаны пищей, и все животные в конечном итоге зависят от растений. В схеме Элтона травоядные были «базовым классом в обществе животных», выше располагался класс хищников, еще выше – класс более крупных хищников, питавшихся хищниками первого порядка, и т. д. вплоть до животного, «не имеющего естественных врагов», на котором заканчивается пищевая цепь.
По Элтону, структура таких пищевых цепей связана с размерами существ, находящихся на разных уровнях.
Размеры пищи
Большая птаха не склюет мелкого зернышка.
Элтон доказывал, что размер – основной определяющий фактор в структуре пищевой цепи. Если съестное слишком крупное, чтобы его переварить, либо слишком мелкое, чтобы животное могло им насытиться, такая еда исключается из рациона: «Размер добычи хищников ограничен в восходящем направлении силой хищника и его охотничьим потенциалом, а в нисходящем – возможностью наловить мелкую добычу в достаточном количестве, чтобы ею можно было прокормиться».
В свою очередь, эти параметры, связанные с размерами, важным образом сказываются на численности различных видов животных в популяциях и в пищевых цепях.
Пирамида чисел
Два тигра не укроются под одним холмом.
Элтон отмечал, что животные, находящиеся в основании пищевой цепи, обычно многочисленны, а те, что ее завершают, – например, тигры – встречаются относительно редко. Как правило, между двумя этими крайностями прослеживается устойчивое снижение численности животных. Элтон назвал эту закономерность «пирамидой чисел».
В качестве примера он приводил английскую дубраву, где можно найти «огромное количество растительноядных насекомых, например тлей, множество пауков и плотоядных наземных жуков, значительное количество мелких певчих птиц и всего одного-двух ястребов». Другой пример, который он лично задокументировал, – арктическая фауна, где обитает огромное количество рачков, которыми питается рыба, рыбу едят тюлени, а тюленей – сравнительно немногочисленные белые медведи. Элтон утверждал, что такие пирамиды существуют в сообществах животных по всему миру.
«Пирамиды чисел» предполагают, что в нормальных условиях в любом регионе численность животных остается сбалансированной. В таком случае возникает фундаментальный вопрос о том, каким образом поддерживается такая плотность: как животные регулируют собственную численность и избегают, с одной стороны, перенаселения, а с другой – вымирания? Элтон полагал, что в целом пределы роста популяции устанавливаются хищниками, патогенами, паразитами и доступностью пищи. Вымирания не происходит, объяснял он: если добычи становится мало, хищники переключаются на другую пищу, позволяя популяции восстановиться.
В свою очередь, нарисованная Элтоном картина регуляции количества животных сближается с кенноновской идеей о гомеостазе – показатели остаются в определенных диапазонах под действием факторов, уравновешивающих друг друга. Элтон не использовал этого термина, Кеннон пока его не популяризовал, но позже это сделали другие экологи.
Элтон считал, что регуляция численности животных – показатель не просто фундаментальный, но и важный с практической точки зрения, поэтому посвятил этой теме почти четверть своей книги. Но он признавался, что «приходилось выражаться общими фразами, так как в настоящее время столь мало известно о законах, регулирующих численность животных».
Действительно, книга Элтона побудила экологов выявлять эти законы регуляции численности животных, подобно тому как работы Кеннона сподвигли психологов искать закономерности, управляющие работой организма у человека и других животных.
Именно об этом мы и поговорим далее.
Но прежде следует упомянуть еще об одном моменте, связанном с публикацией книги Элтона: она породила миф о самоубийстве леммингов. Согласно элтоновскому прочтению книги Коллетта, лемминговый год наступает, когда «целое множество леммингов словно сходит с ума и спускается с гор». Он писал в своей «Экологии животных»: «Лемминги бегут в основном по ночам, они могут преодолеть более сотни миль по суше, прежде чем достигнут моря, а потом просто прыгают в воду и плывут, пока не погибнут». Однако это описание было основано на байках из книги Коллетта. Элтон никогда не видел ни лемминга, ни их миграции, ни тем более массового самоубийства.
Миф о самоубийстве леммингов еще сильнее закрепился после 1958 г., когда вышел диснеевский фильм «Белая пустошь», в котором рассказывалось о леммингах, бегущих к своей смерти. Рассказчик за кадром говорил: «Каждым крошечным грызуном овладевает своеобразное непреодолимое влечение, и он в безумии несется вперед». Зрители видели, как лемминги прыгают в воду с высокой скалы. На самом деле, эта сцена была постановочной: леммингов сбрасывали сами киношники.
Фильм был отмечен «Оскаром».
02
Логика жизни
Все, что подтверждается для E. coli, должно подтверждаться и для слона.
Жак Моно и Франсуа Жакоб
Элтон описал, какую огромную важность имеет регуляция численности животных как в природе, так и для прикладных дисциплин, а Кеннон объяснил, почему физиологическая регуляция критически важна для здоровья животных и человека. Однако, по их собственному признанию, ни то ни другое не позволяло детально судить о количестве тех веществ, уровень содержания которых регулируется в экосистемах или организме.
Проблемы расшифровки законов регуляции для экологов и физиологов были в некоторой степени разными. Элтон и его коллеги обычно могли наблюдать «игроков» невооруженным глазом – речь шла о животных и растениях в конкретном месте. Но экологи не могли докопаться до правил своей игры, так как экология – в основном наблюдательная и описательная, а не экспериментальная наука.
Напротив, Кеннон и его соратники поднаторели в экспериментах, но также не могли работать в полную силу, поскольку в 1930-е гг. изучение физиологии в основном сводилось к наблюдению феноменов, проявляющихся на уровне органов и тканей. «Игроками», регулирующими эти феномены, являются невидимые молекулы, которые сложно выделить и идентифицировать.
В следующих трех главах я расскажу, как были открыты общие и некоторые частные законы физиологической регуляции. Довольно забавно, что первые прорывы в этих исследованиях произошли благодаря существам, не имеющим тела, – бактериям, обитающим в пищеварительной системе человека (глава 3). Однако эти первопроходческие исследования были важны потому, что, хотя рассматриваемые законы и были открыты при изучении бактерий, они действительно оказались универсальными и регулируют всевозможные процессы в разнообразных организмах, в том числе и у нас с вами. Именно по следам этих первопроходцев были открыты частные законы, регулирующие важные аспекты человеческого метаболизма, например переработку холестерина (глава 4) и рост клеток (глава 5). Когда удалось идентифицировать конкретных игроков и правила, по которым они играют, произошла биомедицинская революция, превзошедшая самые оптимистичные прогнозы Кеннона, – он и вообразить не мог ничего подобного.
Открытие универсальных законов оказалось важным еще по двум причинам. Во-первых, на этих законах основана так называемая логика жизни (термин предложен одним из первых молекулярных биологов Франсуа Жакобом). Термин используется как в формальном смысле (если А регулирует B, а B регулирует C, то A регулирует C), так и в более вольной коннотации: регуляторная логика имеет смысл для организма. В той же коннотации Кеннон употреблял выражение «мудрость тела». Я полагаю, что, уловив эту логику, можно значительно лучше понять, как устроена жизнь.
Вторая причина важности этих универсальных законов и одна из основных причин, по которым я написал эту книгу и структурировал ее именно так, заключается в том, что аналогичные законы и логика действуют и в экологических масштабах. Я перейду к конкретным экологическим законам ниже, в части III, но предупреждаю вас о важности и сходстве этих уровней логики уже сейчас, чтобы в нескольких следующих главах вы обращали внимание на детали каждой из изложенных историй.
Глава 3. Общие правила регуляции
Итак, работа клетки изменяется в зависимости от ее потребностей. Клетка производит лишь то, в чем нуждается, и тогда, когда в этом нуждается.
Франсуа Жакоб
Не только в Великобритании были заинтересованы исследованием полюсов. В первой половине XX в. многие государства снаряжали экспедиции на крайний север и крайний юг планеты, руководствуясь стратегическими и экономическими соображениями, иногда – ради национального престижа, а порой и из научного любопытства.
Одиннадцатого июля 1934 г. трехмачтовый французский корабль под названием «Пуркуа па?» («Почему бы и нет?») вышел из порта Сен-Мало в Нормандии и отправился к ледяным берегам Гренландии. Среди членов команды был и прославленный исследователь-полярник Жан-Батист Шарко. Шарко учился на врача, но отошел от медицины и сделал себе имя как участник двух арктических экспедиций, профинансированных французским правительством: на кораблях «Франция» в 1903–1905 гг. и «Пуркуа па?» в 1908–1910 гг. Пришлось немало вынести: льды, штормы, морозы до 40 с лишним градусов, длинная полярная ночь. Но Шарко открывал новые земли, нанес на карту более 1800 миль материкового и островного побережья, стал национальным героем и вызывал у коллег-исследователей неподдельное восхищение. После Первой мировой войны он заинтересовался Арктикой. Это путешествие было 25-й полярной экспедицией в карьере 67-летнего исследователя, причем он уже в десятый раз отправился к Гренландии.
Рис. 3.1
Корабль «Пуркуа па?» в Гренландии
Снимок Жака Моно, © Институт Пастера/Архив Жака Моно
Команда корабля состояла из 35 человек, все они были добровольцами. Кроме того, на борту были шестеро студентов, четверо из которых сошли на берег близ деревни Ангмагссалик, где собирались прожить год среди эскимосов, занимаясь этнографическими исследованиями. Еще двое планировали вести научную работу на борту и на берегу – одним из них был 24-летний Жак Моно.
Моно вырос близ знаменитого приморского курорта Канны. Он был опытным яхтсменом, но по сравнению с командой Шарко – просто дилетантом. Ранее ему не доводилось бывать в таких морях, куда сейчас лежал путь. Молодой зоолог отложил исследования, которыми занимался в парижской Сорбонне, сочтя за честь присоединиться к группе Шарко и отправиться в двухмесячное плавание по Арктике, что было для него настоящим приключением. Его обязанности были приблизительно теми же, что и у Элтона с соотечественниками, – собирать образцы.
Спустя 12 дней после выхода из Франции корабль причалил к окутанным туманом Фарерским островам. Подремонтировав поврежденный бойлер, команда взяла курс на Исландию, откуда, пополнив запасы угля, корабль направился в Гренландию. По пути Моно, бросая за борт невод, постоянно собирал планктон – мелких рачков, морских червей и личинок. Корабль уходил во все более высокие широты, с каждым градусом воздух становился холоднее, а на пути встречалось все больше льда. Когда судно подошло к заливу Скорсби на восточном побережье Гренландии, путь ему преградили ледовые поля. Пять дней корабль медленно продирался через них, дозорный в «вороньем гнезде» выискивал проходы между льдин, которые иногда закрывались столь же быстро, как и возникали, а другие члены команды на корме отталкивали льдины, чтобы те не повредили винт.
Когда Моно наконец высадился на берег, у него было всего три дня на сбор образцов прибрежной морской фауны, а затем корабль уходил в Ангмагссалик (ныне – Тасиилак). Моно с товарищем хотели пособирать породы и минералы, для этого стали подниматься в горы по берегам фьорда. Моно, страстный скалолаз, был очарован всем, что перед ним открывалось. «Я видел столько всего красивого и невероятного! – писал он родителям. – Дорогие мои, если бы вы знали, насколько я поражен, просто дух захватывает!»
Запасы угля на корабле иссякали, требовалось отправиться в Исландию и пополнить их. Корабль то и дело сотрясали ураганные ветры. Приходилось лавировать между айсбергами в условиях плохой видимости, но Шарко решил, что путь нужно продолжать во что бы то ни стало, так как уголь был на исходе. Команде удалось добраться до Рейкьявика, загрузить корабль углем и добраться домой без происшествий.
Моно опубликовал предварительный отчет о своих коллекциях и наблюдениях, но, увы, ему не довелось стать биологом-полярником. Через два года его вновь пригласили на «Пуркуа па?», отправлявшийся в новую экспедицию к Гренландии. Моно был склонен согласиться, но в последний момент передумал и отправился в Калифорнийский технологический институт изучать генетику в лаборатории нобелевского лауреата Томаса Ханта Моргана.
Это решение оказалось для Моно очень удачным. Пятнадцатого сентября 1936 г. «Пуркуа па?» вновь остановился в порту Рейкьявика, пережидая шторм, – корабль пришел из Гренландии, куда доставлял припасы. Затем судно отправилось домой, но через несколько часов попало в жестокий шторм. Рано утром 16 сентября косые паруса судна были изорваны в клочья, а затем корабль потерял фок-мачту и радиоантенну. Искалеченный парусник лег в дрейф, пошел боком и разбился о рифы. Шарко, а вместе с ним все, кроме одного, члены экипажа (43 человека) погибли в студеном бурном море.
К счастью для биологии, Моно сохранил жизнь. Хотя он и ничего не открыл, будучи в Калифорнии, позже Моно стал одним из основателей новой дисциплины – молекулярной биологии. Ему и его коллегам предстояло открыть первые общие законы регуляции жизни на молекулярном уровне, и именно благодаря этим открытиям Моно вновь отправился на север – в Стокгольм, получать Нобелевскую премию.
Но сначала ему предстояло пережить длительную смертоносную бурю.
Рост… прерывается
После работы в Калифорнии Моно вернулся в Париж, где возобновил исследования в Сорбонне, пытаясь определить такую научную проблему, решение которой позволило бы ему претендовать на соискание докторской степени.
Биология тогда занималась достаточно простыми вопросами, ведь так мало было известно о процессах, происходящих в живых клетках. Одна из основных характеристик, присущих всем клеткам, заключалась в том, что они размножаются делением. Сами вопросы были весьма «элтоновскими»: какие питательные вещества нужны клетке? От чего зависит количество клеток?
Прежде чем отправиться в Калифорнию, Моно уже начал эксперименты в этой области. Но первыми организмами, которых он взялся изучать, были одноклеточные простейшие, которые очень плохо росли в лабораторных условиях – неважный материал для исследования. Андре Львов, микробиолог, работавший поблизости в Институте Пастера, предложил Моно поработать с бактериями, которые очень хорошо выращиваются в культурах и очень быстро делятся.
Прежде исследователи готовили «мясные бульоны» для выращивания бактерий из малопитательных ингредиентов. например из перетертого говяжьего мозга. Первым достижением Моно стало то, что он приготовил «бульон» из тщательно подобранных компонентов. Для этого он поставил ряд экспериментов, систематически меняя практически все ингредиенты по очереди и отслеживая, как это сказывается на росте бактерий. Один из первых его значимых результатов заключался в следующем: Моно показал, что степень бактериального роста прямо пропорциональна объему доступного источника энергии, содержащего углерод (речь о сахаре, например о глюкозе или манните). Это наблюдение позволяло вывести очень простую зависимость между питанием и ростом: бактерии перерабатывали доступную пищу и благодаря этому размножались.
Летом 1939 г. Моно плодотворно работал, но над Европой вновь нависли тучи войны. Как и многие французы, Моно не замечал надвигавшейся беды. Тридцать первого августа 1939 г. он писал отцу: «Войны не будет. Гитлер понимает, во что она ему обойдется». На следующий день Германия вторглась в Польшу, в ответ Франция и Великобритания объявили войну Германии.
Война между Францией и Германией началась не сразу – шли дни, недели, затем потянулись месяцы без боев. Моно беспокоился, что если военные действия действительно начнутся, то его призовут на какую-нибудь постылую нестроевую службу, учитывая, что ему было уже 30. Моно хотел использовать свой научный талант и принести реальную пользу, поэтому решил покинуть Сорбонну и записаться в армию на должность офицера связи.
Только Моно прошел начальную подготовку, как наконец разразилась война – 10 мая 1940 г. Германия предприняла масштабное наступление в Нидерландах, Бельгии и Северной Франции. Французская армия была разбита за считаные дни; полк Моно даже не успел выдвинуться из части, когда все было практически кончено. Моно вновь повезло – он не стал военнопленным. После капитуляции Франции он вернулся домой и возобновил исследования в оккупированном немцами Париже.
Что по вкусу бактериям?
В 30 лет Моно был уже староват для аспиранта. Он отчаянно пытался найти научную проблему, которая позволила бы ему закончить работу над диссертацией. Моно провел множество экспериментов, изучая рост бактерий в питательных средах, содержащих те или иные сахара. Осенью 1940 г. он решил исследовать, что произойдет, если предложить бактериям различные комбинации сахаров.
Изобразив на графике изменение концентрации бактерий с течением времени, Моно заметил знакомые кривые роста, напоминавшие те, что были получены при работе с одним видом сахара. На этих кривых прослеживались три характерных этапа: краткая латентная фаза, после которой следовала фаза экспоненциального роста бактерий (их численность удваивалась раз в полчаса-час) и, наконец, фаза стабильности, когда численность бактерий прекращала расти. Но при определенных комбинациях сахаров кривая приобретала иную форму. В ней прослеживалось две фазы роста, между которыми наблюдалась еще одна фаза задержки (рис. 3.2).
Озадаченный Моно показал свои кривые «двойного роста» Львову. Старший коллега задумался, а затем сказал: «Это может быть как-то связано с ферментной адаптацией».
Рис. 3.2
Открытая Моно кривая двойного роста. Когда бактерии выращивались в глюкозе и маннозе, наблюдалась ровная кривая (слева), но когда их выращивали в глюкозе и мальтозе, сначала бактерии размножались экспоненциально, затем наступала небольшая пауза (указано стрелкой), после чего экспоненциальный рост возобновлялся (справа). Эта пауза и вторая часть растущей кривой стали основой для диссертации Моно и в итоге привели его к Нобелевской премии
Рисунок Лиэнн Олдз на основе оригинального материала из лабораторных заметок Жака Моно
«Ферментная адаптация? Никогда о ней не слышал», – ответил Моно.
Львов дал Моно несколько старых статей, в которых описывался следующий феномен: бактериальные или дрожжевые клетки приспосабливаются к присутствию питательного вещества, вырабатывая фермент, который его расщепляет. Фазы задержки на кривых Моно, возможно, соответствовали тому времени, которое требовалось микробам для адаптации к каждому типу сахара. Но оставалось полнейшей тайной, как простейшие микробы «узнавали», что нужно вырабатывать определенный фермент в ответ на присутствие того или иного вещества. Моно сразу же решил взяться за разгадку этой тайны.
Моно обнаружил, что очертания второй кривой роста зависели от того, какой именно сахар применялся в опыте. Таким образом, бактерии предпочитали одни сахара другим. Они были готовы с ходу питаться одними сахарами, но им требовалось время, чтобы адаптироваться к менее подходящим сахарам, выработать ферменты, необходимые для их усвоения. Моно подозревал, что двойная кривая роста возникает по такой причине: сначала бактерии расходуют весь более питательный сахар, затем, после небольшого перерыва, адаптируются к потреблению другого, не столь вкусного сахара.
Чтобы проверить эту гипотезу, он просто варьировал содержание определенных сахаров в разных экспериментах. Моно рассуждал, что если его версия верна, то длина фаз роста при потреблении каждого из сахаров будет соответствующим образом изменяться. Именно это он и увидел.
Львов впечатлился умением Моно разрабатывать такие прицельные эксперименты, позволявшие проверить любой интересовавший его аспект. Сорбонна присудила Моно ученую степень, однако научный совет заявил: «Работы Моно Сорбонне неинтересны».
Моно надеялся изучать ферменты, синтезируемые бактериями в ответ на присутствие тех или иных сахаров, но прежде, чем ему удалось добиться какого-либо результата, его работа вновь была прервана. Немецкая оккупация продолжалась, накалялась обстановка в Париже, и там становилось все опаснее находиться Одетте, супруге Моно, поскольку она была еврейкой. Она покинула столицу и вместе с детьми отправилась в более спокойное место на юге Франции. Моно полагал, что с высадкой союзников в Европе начнется вторая битва за Францию, поэтому примкнул к одной из наиболее воинственных групп французского Сопротивления – «Франтиреры и партизаны» (FTP).
Моно стал заниматься разведкой и координировать поставки оружия от союзников. Много месяцев Моно вел двойную жизнь, будучи ученым Сорбонны и агентом Сопротивления, – даже прятал компрометирующие документы в ноге у чучела жирафа рядом с лабораторией. Но по мере того, как немцы все жестче наседали на Сопротивление, а некоторых командиров и соратников Моно арестовали и пытали, ему стало слишком опасно работать в Сорбонне и даже ночевать дома. Львов предложил Моно укрыться в Институте Пастера, где ему удалось продолжить эксперименты еще несколько месяцев. В конце концов Моно пришлось отказаться от лабораторной работы. Он окончательно ушел в подполье, изменил внешность и стал бывать только на конспиративных квартирах (рис. 3.4).
Рис. 3.3
Пропорции каждой части двойной кривой роста зависят от соотношения двух сахаров. Когда Моно смешивал два сахара в долях 1:3, 2:2 и 3:1, первая часть кривой роста пропорционально удлинялась, а вторая укорачивалась. Таким образом, бактерии потребляли сначала один вид сахара, а затем второй
Из работы Моно (1942), адаптировано Лиэнн Олдз
Рис. 3.4
Удостоверение Жака Моно, участника французского Сопротивления, 1944 г. Моно носил звание команданта FFI. Пользовался псевдонимом Маливер, так как члены Сопротивления не могли действовать под настоящими именами
Документ публикуется с разрешения Оливье
Моно дослужился до офицерского чина в национальной организации Сопротивления «Французские внутренние войска» (FFI), в составе которой участвовал в координации саботажа и даже в казни предателей-коллаборационистов. Моно был одним из командиров, участвовавших в битве за освобождение Парижа в августе 1944 г. Затем он служил офицером французской армии вплоть до капитуляции Германии.
Какие законы управляют регуляцией ферментов?
Война отняла шесть лет у Моно, его семьи и родины. Когда она наконец закончилась, Моно стремился оставить эти темные времена в прошлом, поэтому с головой окунулся в исследования. Львов предложил ему штатную должность в Институте Пастера, и Моно согласился.
Он вернулся к той работе, которую прервала война. Ферментная адаптация крайне привлекала его своей логичностью: как бактерия, столь крошечная, едва различимая в микроскоп, не имеющая никакой нервной или эндокринной системы, – просто пузырек с химическими веществами, заключенными в мембрану, – «узнавала», какой именно фермент производить для переработки имевшегося сахара?
Ферменты – это белки, а клетки синтезируют сотни различных белков. Моно понял, что этот вопрос, в сущности, является вопросом регуляции: как клетка «решает» производить в конкретных условиях какой-то определенный фермент, но не другие?
Моно верил, что его исследования регуляции бактериальных ферментов позволят разобраться отнюдь не только в гастрономических пристрастиях микробов-сладкоежек. Он понимал, что отличия между разными типами клеток в организмах более сложноорганизованных существ также определяются регуляцией. Например, эритроциты синтезируют белковую часть гемоглобина, транспортирующего кислород, а лейкоциты синтезируют белки антител, борющихся с инфекциями. Моно полагал, что, если понять, почему и как бактерия синтезирует определенный фермент, это поможет пролить свет на образование различных типов клеток.
Чтобы хоть немного проникнуть в эту тайну, он решил сосредоточиться на одном сахаре – это был молочный сахар лактоза – и исследовать одного «ключевого игрока» – бактериальный фермент, разлагающий лактозу на галактозу и глюкозу. Этот фермент называется -галактосидазой. Бактерии предпочитают извлекать энергию из простых сахаров. Чтобы использовать лактозу – соединение, состоящее из двух сахаров, глюкозы и галактозы, – эту молекулу требуется расщеплять надвое.
В конце 1940-х и начале 1950-х молекулярная биология только зарождалась, было сложно понять, как ставить большинство экспериментов. Моно и его группа превосходно разрабатывали технологии, позволявшие интерпретировать различные возможности. Основное наблюдение заключалось в следующем: фермент начинал образовываться благодаря присутствию сахара. Возможное объяснение было таким: сахар каким-то образом активировал фермент, непосредственно связываясь с уже имеющейся неактивной формой фермента в бактериальной клетке и преобразуя этот фермент в активную форму. Разработав ряд умных и технически нетривиальных экспериментов, Моно с коллегами отбраковали эту идею.
Опыты Моно показали, что лактоза жестко регулировала производство фермента. Когда E. coli росла в отсутствии лактозы, во всей клетке можно было найти всего несколько молекул фермента -галактосидазы. Стоило добавить лактозу, и всего за несколько минут в одной клетке появлялось уже несколько тысяч таких молекул. При удалении сахара синтез фермента прекращался (рис. 3.5). Такое включение и выключение производства фермента непонятным образом зависели от присутствия или отсутствия сахара. Принято говорить, что сахар является индуктором синтеза фермента.
Со стороны бактерии это было весьма логично: она синтезировала фермент только при наличии лактозы (источника пищи) и не тратила энергию на производство фермента впустую, когда лактозы вокруг не было. Но как работала эта логика?
Моно несколько лет не удавалось уловить законы регуляции синтеза ферментов. На то было две причины. Во-первых, у него существовало предубеждение насчет того, как может работать логика регуляции. Простое наблюдение показывало: бактерия синтезирует фермент в присутствии сахара, индуктора. Моно и его коллеги продолжали воспринимать индуктор как нечто положительно контролирующее синтез ферментов (здесь и далее схематически изображается стрелкой ).
Чтобы совершить прорыв, им оставалось открыть еще одного «ключевого игрока» и прийти к обратной логике.
Я объясню, как они в итоге во всем разобрались, но верная логика настолько важна для понимания регуляции и всей книги, что я не хотел бы, чтобы вы увязли в этих экспериментальных деталях и упустили общую картину. Поэтому сразу расскажу вам, о чем не догадывался Моно и как лактоза регулирует синтез ферментов. Затем вернусь к этому месту и опишу, как Моно с коллегами во всем разобрались.
Тем «игроком», которого требовалось открыть Моно, был другой белок, действующий в качестве посредника между ферментом и лактозой. Этот белок называется репрессором, так как его задача заключается именно в угнетении синтеза фермента -галактосидазы. Такая обратная логика осознается, как только понимаешь, что лактоза не оказывает прямого положительного контроля на синтез фермента. На самом деле лактоза ингибирует репрессор, который в таком случае прекращает угнетать синтез фермента.
Рис. 3.5
Индуцирование синтеза фермента. Когда индуктор, например лактоза, добавляется в популяцию E. coli, синтезируется фермент -галактосидаза. При удалении индуктора синтез фермента останавливается
Из работы Моно и Жакоба (1961), перерисовано Лиэнн Олдз
Логика такова: минус на минус дает плюс.
Закон двойного отрицания при ферментной регуляции имеет огромный биологический смысл: в отсутствии лактозы фермент, расщепляющий сахар, не нужен, и репрессор не дает синтезировать фермент (ниже и далее в книге отрицательная регуляция обозначается символом ); если лактоза присутствует, то она ингибирует репрессор; таким образом, ген фермента включается, фермент расщепляет сахар и обеспечивает клетку энергией.
Такая красивая логика и экономия у простейшей бактерии.
Чуть ниже я подробно расскажу, как работает репрессия, но, на мой взгляд, важность ферментной регуляции здесь и далее в контексте книги заключается не в тонкостях, а в логике как таковой. Прорыв удалось совершить, как только ученые начали мыслить непредвзято. Наблюдая какой-либо феномен, мы склонны выбирать наиболее прямолинейное объяснение, где цепочка причинно-следственных связей состоит из минимального количества звеньев. Если мы видим, как машина едет по улице, то считаем, что водитель жмет газ, а не отпускает тормоз.
Когда наличие A (например, сахара) приводит к появлению B (фермента), мы логически выводим положительную связь: A вызывает B. Нужно подключить воображение, чтобы представить себе иное объяснение: A ингибирует нечто третье (репрессор), который в свою очередь ингибирует B.
Но оказывается, что жизнь – от молекулярного уровня вплоть до экологического – обычно управляется более длинными цепочками причинно-следственных связей, чем кажется на первый взгляд, с большим количеством звеньев. Нужно знать каждое из этих звеньев и природу взаимодействий между ними, чтобы по-настоящему понимать законы регуляции и уметь вмешиваться в их работу.
Чтобы открыть репрессор и понять логику ферментной регуляции, Моно требовалось выйти из плоскости.
Открытие репрессора
Новый подход заключался в использовании генетики. Допустим, вас интересует, как приобретается какой-либо видимый признак, например розовый оттенок цветка. Можно найти ответ методом биохимии: растереть цветок и попытаться выделить все его ферменты, благодаря которым розовый оттенок возникает на материале простых химических веществ. Этот метод сложный и длительный.
Либо можно использовать генетику. Берем семена нескольких растений с розовыми цветами, выращиваем тысячи цветов и ищем среди них те немногие, лепестки которых оказались не розовыми, а, например, белыми. У каждого такого цветка имеется генетический дефект, мутация в гене, отвечающем за розовый цвет лепестков. Затем займемся изучением этих генов.
Значительное преимущество генетического подхода заключается в том, что он объективен, и нам достаточно просто взглянуть на цветы, чтобы найти растения с мутациями в интересующих нас генах. Мы не делаем никаких предположений о количестве «игроков» и о том, что они делают. Генетический метод позволяет обнаружить «игроков», к примеру, не являющихся ферментами. Катализатором многих важнейших прорывов в биологии и медицине за последние полвека оказался генетический метод. В следующих двух главах я приведу два важных примера такого рода из области медицины.
Моно с коллегами искали у бактерий такие мутации, которые нарушали синтез -галактосидазы. Они выделили два типа мутантов. У первых синтезировался дефективный фермент -галакосидаза, что было связано с мутациями в самом гене, кодирующем этот фермент. Такие мутации были ожидаемы. Но особенно интересны были мутации второго типа: мутантные бактерии синтезировали фермент и в отсутствие лактозы. Они производили фермент все время (конститутивно), независимо от наличия лактозы. У этих мутантов была нарушена нормальная регуляция синтеза фермента, механизм «включения» и «выключения». Конститутивные мутации возникали не в гене фермента, а в другом гене, но каким-то образом нарушали ферментную регуляцию.
Понимание того, как действует этот «игрок», стало ключом к пониманию ферментной регуляции. Но сперва Моно был озадачен. Он попытался интерпретировать конститутивных мутантов сквозь призму индуктора, действующего в качестве положительного регулятора синтеза фермента. Ученый рассуждал, что если мутантная бактерия не нуждалась в индукторе, чтобы синтезировать фермент, то мутанты должны сами синтезировать «внутренний» индуктор -галактосидазы. Ошибку в логике Моно удалось обнаружить только после того, как к работе подключился новый человек.
Открытие закона двойного отрицания
Этим человеком стал Франсуа Жакоб. До войны Жакоб планировал стать хирургом, но его карьера рухнула после тяжелого ранения в Нормандии, которое он получил, будучи фронтовым врачом. Тогда Жакоб занялся наукой и по счастливой случайности оказался в лаборатории Львова, совсем рядом с Моно. Жакоб изучал другой феномен: он интересовался тем, как бактериальным вирусам удается подолгу скрываться внутри бактерий, пока какой-нибудь фактор не спровоцирует взрывное размножение такого вируса. Достаточно скоро Жакоб разработал важные методы изучения бактериальных генов. Он присоединился к Моно в 1957 г., и его новый инструмент генетического характера наконец-то позволил разгадать логику ферментной регуляции.
В отличие от людей и большинства животных, у которых имеется по две копии каждой хромосомы (по одной от каждого из родителей) и по две копии большинства генов, у E. coli каждая хромосома и каждый ген присутствуют в одном экземпляре. Одним из передовых приемов, которым стал пользоваться Жакоб, стала передача генов от бактерии к бактерии. Таким образом ему удалось получить бактерии с дополнительными копиями генов и проверить, как влияет на бактерию смешивание мутантных генов с обычными. Если Моно был прав насчет конститутивных мутантов, то при совмещении в одной бактериальной клетке нормальной и мутантной копии гена должен был образовываться внутренний индуктор, что привело бы к постоянному синтезу фермента.
Но когда Жакоб и прикомандированный американский ученый Артур Парди поставили такой опыт, они получили прямо противоположный результат: чтобы синтезировать фермент, бактерии требовался индуктор (лактоза). Сначала исследователи растерялись. Может быть, они допустили какую-то техническую ошибку? Но дело было не в этом: повторные эксперименты давали аналогичный результат.
Если технических ошибок не было, то, возможно, были логические. Действительно, именно на это указал Моно и Жакобу Лео Сцилард, физик, ставший биологом и часто наведывавшийся в Институт Пастера. Может быть, они неверно понимали индуктор? Может быть, индуктор не запускает синтез фермента напрямую, как полагал Моно, а ингибирует отрицательный регулятор синтеза фермента?
Бинго. Закон двойного отрицания все ставил на свои места.
Конститутивные мутанты не синтезировали внутренний индуктор, просто у них в ферментной регуляции не хватало одного звена – репрессора синтеза фермента. Из-за отсутствия репрессора мутанты могли непрерывно синтезировать фермент без индуктора. А когда у бактерии была одна рабочая копия гена репрессора и одна – мутантная, рабочая копия доминировала и угнетала синтез фермента до тех пор, пока не поступал индуктор.
Как только Моно и Жакобу удалось избавиться от ошибочной трактовки, предполагавшей простые причинно-следственные связи, они стали мыслить по-новому и обнаружили закономерности, которые ранее не могли заметить ни они, ни кто-нибудь еще.
Однажды воскресным вечером Жакоб с женой смотрел фильм в парижском кинотеатре. В какой-то момент он отвлекся и погрузился в мысли о тайне, которую пытался разгадать уже много лет. В некоторых бактериях находились скрытые вирусы, которые могли обнаружить себя под действием ультрафиолета. Жакоб не мог понять, как действует этот механизм. Идея о возможной связи между тем, чем занимается Жакоб, и исследованиями Моно, осуществляемыми в другом конце коридора института, никому и в голову не приходила. По крайней мере до тех пор, пока в темноте кинозала перед мысленным взором Жакоба не возник вирус, каким-то образом упакованный со всем множеством своих генов внутри бактерии.
Тут ученого осенило: активация вируса подчинялась той же логике, что и двойной отрицательный механизм индуцирования ферментов. Вероятно, вирусные гены также угнетались репрессором до тех пор, пока этот репрессор не разрушался или не исчезал под действием ультрафиолета, что позволяло включиться вирусным генам.
То, что представлялось положительной активацией, на деле опять оказалось ингибированием репрессора.
Получив в качестве подтверждения два, казалось бы, совершенно разных феномена, Моно и Жакоб предположили, что в клетке присутствуют белки двух основных типов: структурные (например, ферменты, катализирующие химические реакции в клетках, или белки, образующие части вируса) и регуляторные (контролирующие, какие структурные белки будут или не будут синтезироваться в зависимости от условий). Итак, на уровне регуляции не все белки равны. Некоторые белки нужны для контроля над другими. Моно теперь мог всегда определить отрицательную регуляцию и найти ее другими способами.
Обратная связь
Бактерии и другие организмы способны не только расщеплять питательные вещества на полезные соединения, но и синтезировать важные соединения из более простых компонентов. Белки, осуществляющие всю работу в живом организме, состоят из «кирпичиков», называемых аминокислотами. Если выращивать бактерии в простом растворе, где содержится два источника углерода – глюкоза и углекислый газ, – то они могут синтезировать все 20 аминокислот.
Однако если предложить бактерии конкретные аминокислоты, то синтез других аминокислот быстро прекращается. Такая стремительная реакция подсказывает, что при изобилии определенной аминокислоты бактерия активирует особый механизм, останавливающий работу синтезирующих ее ферментов.
В 1950-е многие биохимики напряженно пытались определить, какими способами синтезируются различные аминокислоты. Они обнаружили, что синтез каждой аминокислоты обычно «включает» многоэтапный «путь», на котором первичный химический предшественник (P) изменяется в ходе последовательных реакций с участием ферментов и превращается в аминокислоту. Эти «пути» схематически изображаются как цепочки последовательно возникающих продуктов реакций (I1, I2 и т. д.), причем продукт каждой реакции возникает под действием отдельного фермента.
Р I1 i2… аминокислота
Например, удалось установить, что если предоставить бактериям аминокислоту триптофан, то останавливается синтез промежуточного вещества. Это означает, что триптофан действует на фермент, находящийся в начале «пути». Аналогичным образом выяснилось, что при наличии аминокислоты изолейцина также ингибируется действие первого фермента в его синтетическом «пути».
Благодаря этим открытиям появилась концепция отрицательной обратной связи, согласно которой соединения реагируют на собственный синтез, и тем самым осуществляется контроль уровня веществ в клетках. Впоследствии изучение всевозможных биосинтетических «путей» показало, что отрицательная обратная связь не просто распространена, но и практически всегда осуществляется последним компонентом биохимического «пути», ингибирующим первый фермент данного «пути».
Подобно закону двойного отрицания индуцирования ферментов, закон отрицательной обратнй связи в биохимических «путях» также имеет огромный биологический смысл: при переизбытке конечного продукта биохимического «пути» клетки не тратят энергию на синтез этого вещества или каких-либо промежуточных продуктов, но, когда концентрация низка, механизмы синтеза не ингибируются, и клетка получает нужный продукт.
Эти первопроходческие исследования бактерий выявили четыре основных способа, которыми одни молекулы могут влиять на множество молекул другого вещества. Эти способы базируются на наборе общих правил и на логике регуляции, которая, как мы увидим, управляет разнообразными процессами в живых организмах (если хотите, сделайте закладку на этой странице).
Второй секрет жизни
Открытие репрессоров и ингибирования по типу обратной связи подогрело интерес к следующей проблеме: как именно два этих вида регуляции действуют на молекулярном уровне. Что именно делает репрессор? Как действуют индукторы? Как осуществляется обратная связь?
Однажды поздним вечером осенью 1961 г. Жак Моно вошел в лабораторию к своей коллеге Агнес Улльманн. Моно, обычно одетый с иголочки, энергичный, выглядел усталым и обеспокоенным, его галстук был расслаблен. Выдержав некоторую паузу, он сказал Улльманн: «Думаю, я открыл второй секрет жизни».
Улльманн подумала, что Моно выглядит неважно, поэтому предложила ему присесть и выпить виски – это был любимый напиток Моно. Пропустив один-два стаканчика, Моно встал и пустился в долгие объяснения. Он был не болен. В отличной форме. Моно еще раз рассмотрел многолетние наблюдения репрессии и ингибирования по типу обратной связи и наконец предложил унифицированное объяснение обоих феноменов.
Моно совершил этот прорыв, зарисовав контуры и размеры молекул. Он размышлял о ферменте, который тогда исследовали у него в лаборатории. Ферменты – это крупные белки, их молекулы более чем в 100 раз превосходят по размеру молекулы тех веществ, на которые они воздействуют (так называемые субстраты), – например, молекулы сахаров или аминокислот. Подобно тому как ключ входит в замок, субстрат плотно входит в просвет фермента, именуемый активным центром, где он расщепляется или видоизменяется.
Фермент, изучением которого тогда занимался Моно, является первым веществом в биохимическом «пути», приводящем к синтезу аминокислоты изолейцина. Он воздействует на субстрат под названием «треонин» и ингибируется изолейцином – конечным продуктом данного биохимического «пути». Моно пытался понять, как маленькая молекула изолейцина может вклиниться в активный центр фермента и выключить его. Но тут его осенило: изолейцин совсем не похож по форме на треонин. Может быть, он просто не влезает в эту полость?
Затем Моно подумал о других ферментах, ингибируемых по типу обратной связи, и осознал, что с ними происходит то же самое: они ингибируются молекулами, очень отличающимися по форме от молекул субстратов. Что бы это значило? Моно понял, что место, к которому прикрепляется ингибитор, не должно совпадать с активным центром. В ферменте – «замке» – должно быть две «скважины»: одна – для субстрата, и одна – для ингибитора.
Каким-то образом связывание с ингибитором изменяло форму фермента таким образом, что он больше не мог связываться со своим субстратом («скважина» закрывалась). Моно назвал этот феномен аллостерией (от греческих слов «allos» – «другой» и «stereos» – «пространственный, объемный»). Ученый считал аллостерию важным механизмом, регулирующим работу белков (рис. 3.6, вверху).
В тот памятный вечер вся мозаика сложилась. Индуктор и репрессор действовали по тому же принципу, что и обратное ингибирование, – путем аллостерии. Репрессор также должен был иметь два активных центра: один – для связывания ДНК, другой – для индуктора. Когда индуктор отсутствует, репрессор связывается с ДНК и таким образом выключает ген; когда индуктор есть и связывается с репрессором, физическая форма репрессора из-за этого изменяется, репрессор не может связаться с ДНК, и это позволяет гену включиться (см. рис. 3.6, внизу).
Моно мог двумя путями доказать простую, но великую унифицирующую идею: мелкие молекулы (аминокислоты, индукторы) управляют формой и активностью крупных молекул (белков). Объединив два, казалось бы, неродственных феномена – репрессию ферментов и ингибирование по типу обратной связи, – Моно определил потенциальные общие принципы. Аллостерия, например, позволяла объяснить, как небольшие молекулы гормонов или нейротрансмиттеров регулируют работу эндокринной и нервной системы. Моно, потрясенный вероятными масштабами этой идеи, отправился к Улльманн, чтобы услышать ее мнение.
Рис. 3.6
Аллостерия – основа ингибирования по типу обратной связи и индукции ферментов. Сверху: субстрат входит в активный центр фермента; ингибитор – в другую щель. Когда ингибитор прикрепился, форма активного центра видоизменяется таким образом, что субстрат в него больше не входит. Снизу: один центр репрессора связывает ДНК, другой – лактозу. Когда лактоза прикрепится, форма репрессора изменяется, и он больше не связывает ДНК, поэтому может включиться ген фермента
Иллюстрация Лиэнн Олдз
Тогда как ДНК была первым секретом жизни, аллостерия, вероятно, была вторым, поскольку позволяла понять, как регулируется работа генов и белков. Нобелевский комитет счел это, как и все остальные открытия Моно и Жакоба, достойным Нобелевской премии по физиологии и медицине, которая и была присуждена им в 1965 г.
E. coli и слоны
Важность исследований Моно и Жакоба определялась не конкретными деталями разгадки тайны регуляции фермента -галактосидазы у E. coli. Сила их идей, как и идей Элтона и Кеннона, заключалась в оригинальности и универсальности открытых учеными законов регуляции.
Подобно тому как Элтон представил экосистему в качестве сообщества организмов, взаимодействующих друг с другом при помощи пищевых цепей, а Кеннон – тело как систему органов, связанных на уровне нервной и эндокринной системы, Моно и Жакоб изобразили клеточную жизнь как «сообщество макромолекул, объединенных сложной системой коммуникаций, регулирующих одновременно и синтез, и активность этих молекул».
Моно и Жакоб живо и ярко объяснили, каково значение их открытий, сделанных исключительно при изучении одноклеточных бактерий, для понимания сложных феноменов в жизни гораздо более сложных организмов. Мастерски объединив все, что было изучено к 1961 г., они афористично отметили: «Существует аксиома: все, что подтверждается для E. coli, должно подтверждаться и для слона».
Это было скорее смелое желание, чем проверенный и общепринятый факт, что, однако, не мешало их рассуждениям. Признавая, что регуляция в высших организмах должна быть «неизмеримо» более сложной, они предполагали:
С другой стороны, представляется очень маловероятным, что основные механизмы, выявленные у низших форм, – аллостерическое ингибирование, индуцирование и репрессия – не должны присутствовать у дифференцированных организмов. Понятно, что эти механизмы по природе своей могут быть адаптированы к самым разнообразным ситуациям и могут служить для самых разных целей у E. coli и у человека.
Не только эти механизмы, но и закон отрицательной регуляции представлялась Моно и Жакобу предельно важной для высших организмов. Понимая, что раковые клетки теряют чувствительность к «условиям, контролирующим клеточное деление в здоровых тканях», они предполагали, что онкологические заболевания могут быть обусловлены генетическими мутациями или иными факторами, отключающими репрессор, который управляет делением клеток.
Как мы сможем убедиться в главах 4 и 5, их размышления не просто оказали значительное влияние на развитие науки, но и явились провидческими.
Глава 4. Жиры, обратная связь и чудесный грибок
Можно не заменять гены, а пользоваться принципами регуляции, чтобы хорошие гены работали усерднее.
Доктор Джозеф Голдштейн – доктору Рою Вагелосу, генеральному исполнительному директору компании Merck & Co
Двадцать девятого июня 1935 г. американец Ансел Киз и англичанин Брайан Мэтьюз разбили лагерь близ вершины пика Ауканкильча в северном Чили, на высоте около 6100 м. Они выстроили простое укрытие от снега, вертикально укрепив несколько жердей и накрыв их одеялами, а затем заползли внутрь, чтобы уберечься от ветра и ночных температур – мороз достигал –50 °C. Они оставались в этом лагере целых 15 дней и за это время несколько раз поднимались на вершину. На тот момент пик Ауканкильча являлся одним из самых высоких покоренных пиков в Андах. А эти бесстрашные скалолазы были вовсе не профессиональными альпинистами, а учеными-физиологами: Киз – из Гарварда, а Мэтьюз – из Кембриджского университета. Оба они входили в состав Международной высотной экспедиции (IHAE) из 10 исследователей, отправившихся в Чили, чтобы изучить, как человеческий организм приспосабливается к экстремальным высотам.
На высоте более 5330 м на склоне Ауканкильча находится самое высокогорное постоянное поселение в мире, а на высоте почти 5800 м прорыта самая высотная шахта. Эта «высотнейшая» экспедиция была самым долгим, оснащенным по последнему слову техники и максимально сложным в реализации научным проектом, призванным изучить, как люди могут жить и работать в столь суровых условиях.
Если одним из признаков настоящего ученого является отвага, заставляющая идти туда, куда влечет любопытство, – Кеннон, Элтон и Моно принадлежали к людям именно такого сорта, – то Киз был образцовым представителем этой когорты. Он бросил школу в 15 лет, решив разгребать помет летучих мышей в аризонской пещере, затем трудился на золотом прииске в штате Колорадо рабочим-взрывником – подносил порох рудокопам. Вернувшись в школу и закончив ее, Киз стал изучать химию в колледже, разочаровался и нанялся смазчиком на океанский пароход, ходивший в Китай. Выжив на пайке, состоявшем «в основном из алкоголя», Киз вернулся в колледж, получил степень по экономике, а затем всего за полгода – еще и степень по биологии. Затем он поступил в Институт Скриппса в городе Ла-Хойя, штат Калифорния, где получил степень PhD по океанографии и биологии, потом учился в Кембриджском университете, где получил еще и степень PhD по физиологии. Наконец, он стал работать в Гарвардской лаборатории исследования усталости и занялся организацией экспедиции IHAE в Чили.
Рис. 4.1
Ансел Киз в Андах. У Киза (лежит на спине) берут кровь на высоте 6138 м, чтобы проверить, как организм реагирует на большие высоты
Из работы Keys, A. (1936) «The Physiology of Life at High Altitudes». Scientific Monthly 43(4): 309
Второй по распространенности элемент одиссеи любого ученого – это инстинктивная прозорливость (серендипность). Вспомните злых котов Кеннона, книгу о леммингах, которую Элтон купил в Тромсё, странную кривую роста, обнаруженную Моно. Для Киза подобную роль сыграл вызов из армии. В течение шести дней, проведенных у самой вершины Ауканкильча, Киз и Мэтьюз были вынуждены питаться только сублимированной пищей, запивая ее водой. Разумеется, такой ценный опыт был интересен армейским снабженцам. Когда в Европе началась война, военные сочли, что целесообразно разработать какой-либо легкий непортящийся паек, которым могли бы питаться десантники, дожидаясь подхода основных сил. Поэтому Киза вызвали на консультацию в квартирмейстерскую службу Министерства обороны.
К тому времени Киз перебрался в Университет Миннесоты. К нему в Миннеаполис прибыл полковник, и они вместе пошли за покупками в лучший гастроном городов-близнецов. Потом они распределили еду по бумажным пакетам и отнесли их на местную военную базу для испытаний. После дальнейших исследований, проводившихся на военной базе Форт-Беннинг, штат Джорджия, были определены ингредиенты пайка энергетической ценностью около 3000 калорий. Туда входили: кусок сухой колбасы или банка консервов, сухари, плитка шоколада, полоска жевательной резинки, спички и пара сигарет. Все это упаковывалось в непромокаемый пакет, помещавшийся в кармане. Этот паек стали производить под названием «К-рацион» (где «К» предположительно означало «Киз»), к 1944 г. было выпущено более 100 млн таких пайков.
После войны Киз сконцентрировался на других проблемах. Его заинтересовала статистика из охваченной голодом Европы: там значительно снизилась смертность от сердечных заболеваний, тогда как многие знаменитые американцы умирали от сердечного приступа. Почему у некоторых мужчин случается приступ, а у других нет? Киз набрал мужчин-добровольцев из Миннеаполиса в возрасте от 44 до 55 лет и окрестностей в количестве 281 человек и начал лонгитюдное исследование. Его интересовало, как риск сердечного приступа соотносится с 60 различными факторами, в частности с диетой.
Пока шло миннесотское исследование, Киз ездил по всему миру с лекциями о сердечных приступах. Когда коллега из Неаполя заявил, что в это городе сердечные приступы не представляют особой проблемы, Киз отнесся к этому скептически и решил изучить вопрос. Исследовав группу неапольских пожарных, он обнаружил, что у них в крови гораздо меньше холестерина, чем у американских бизнесменов. Мало холестерина было и у испанских бедняков. Киз счел, что корреляция очевидна: богачи питались более жирной пищей, поэтому у них повышалась вероятность сердечного приступа.
Но коллеги-врачи скептически восприняли идею о связи между диетой, уровнем холестерина в сыворотке крови и сердечными приступами. Поэтому Киз и его соратники организовали беспрецедентное по масштабу международное исследование риска сердечных заболеваний, в котором участвовали более 12 000 мужчин из различных стран мира: Югославии, Италии, Греции, Финляндии, Нидерландов, Японии и США. Рацион в этих странах очень различается. «Исследование семи стран» началось в 1958 г., мужчины должны были проходить обследование каждые пять лет.
В 1963 г. были получены результаты обоих исследований. Наблюдая предпринимателей из Миннесоты в течение 15 лет, Киз выявил основной фактор риска, связанный с сердечными приступами: уровень холестерина в сыворотке крови. У мужчин, имевших более 260 мг холестерина на 100 мл крови, риск сердечного приступа был впятеро выше, чем у мужчин с уровнем холестерина менее 200. «Исследование семи стран», когда были подведены итоги первых пяти лет, показало такой же результат. Например, у жителей восточной Финляндии уровень холестерина составлял в среднем 270 мг, и они умирали от сердечного приступа в среднем впятеро чаще хорватов, уровень холестерина в крови которых не превышал 200 мг.
Теперь Киз располагал серьезными доказательствами, что люди заболевают из-за особенностей своего рациона питания. К тому времени уже на протяжении полувека было известно, что в атеросклеротических бляшках со стенок аорты содержалось как минимум в 20 раз больше холестерина, чем в нормальных тканях аорты. Если животные получали много холестерина с пищей, у них развивались гиперхолестеринемия и атеросклероз. Но именно вышеупомянутые крупномасштабные эпидемиологические исследования помогли обосновать связь между высоким уровнем холестерина и сердечным приступом у человека, привлечь внимание к этому риску.
Однако эти корреляции не объясняли, как лечить сердечников, чтобы восстановить их здоровье. Холестерин – это не угроза, от которой нужно просто избавиться, молекула холестерина жизненно важна. Это важнейший компонент мембран всех животных клеток, он помогает создавать барьеры между отдельными клетками и средой, в которой они находятся. Холестерин модулирует текучесть мембраны и подвижность других молекул внутри нее. Более того, холестерин – представитель важного класса молекул, стеринов, являющихся предшественниками гормонов-стероидов, в том числе кортизола, половых гормонов тестостерона и эстрогена. Также холестерин входит в состав желчи, критически важной для пищеварения. Итак, важная проблема заключалась в следующем: как поддерживать безопасный для здоровья уровень стеринов, то есть гомеостаз холестерина. В начале 1960-х сердечные заболевания являлись основной причиной смерти среди взрослых американцев. Чтобы переломить ситуацию (если это вообще было возможно), требовалось знать законы регуляции холестерина.
Важнейшие сведения о регуляции холестерина удалось получить благодаря двум молодым врачам, которые, вдохновившись идеями Моно и Жакоба, решили действовать точно так же. Во-первых, они стали работать над проблемой сообща. Во-вторых, решили изучать таких людей, у кого была нарушена регуляция синтеза ферментов – как и у конститутивных бактерий-мутантов, с которыми работали Моно и Жакоб. Затем, анализируя эти человеческие мутации, они методично выстроили логику регуляции холестерина. Ровно через два года после Моно и Жакоба эти двое также отправились в Стокгольм – получить свои Нобелевские премии.
Открытие обратной связи
Джо Голдштейн и Майк Браун познакомились в 1966 г., еще будучи интернами в Общеклинической больнице штата Массачусетс в Бостоне, где посменно дежурили в палате интенсивной терапии. Хотя Голдштейн вырос в небольшом городке в штате Южная Каролина, а Браун – в Нью-Йорке и Филадельфии, они сразу нашли общий язык. После длительных дежурств они, в отличие от других молодых врачей, подолгу обсуждали, какие патологии могут быть связаны с теми случаями, что им приходится наблюдать.
Отработав практику в Бостоне, оба перебрались в Национальные институты здравоохранения (NIH) в город Бетесда, штат Мэриленд, где стали клиническими наблюдателями, которые должны были не только заниматься исследованиями, но и вести пациентов. Голдштейн получил назначение в Национальный институт сердца. В самом начале работы ему попались двое особых пациентов – шестилетняя девочка и ее восьмилетний брат, оба ребенка страдали от сердечных приступов. Для Голдштейна это был настоящий момент истины.
Брат и сестра попали в больницу NIH, так как страдали заболеванием под названием «семейная гиперхолестеринемия». Эта наследственная болезнь встречается в двух формах. Первая, гетерозиготная, встречается примерно у одного из 500 человек. У таких людей есть одна копия мутантного гена, из-за которого уровень холестерина держится в диапазоне 300–400, сердечные приступы у них начинаются уже в возрасте около 35 лет. Совсем редко встречается гомозиготная форма, примерно один случай на 1 млн человек. Эти больные имеют две копии мутантного гена, у них совершенно астрономический уровень холестерина (около 800), и сердечные приступы у них начинаются уже в пятилетнем возрасте.
У брата с сестрой из Техаса была именно тяжелейшая гомозиготная форма. Голдштейн рассказал Брауну о детях, и они оба стали размышлять, какой дефект мог спровоцировать такой зашкаливающий уровень холестерина. Несмотря на то что оба были загружены работой в NIH, молодые врачи находили время на вечерние курсы по различным дисциплинам. На одном из этих курсов подробно обсуждались идеи Моно и Жакоба о регуляции. В университете Голдштейн и Браун выучили, что синтез холестерина подчинялся обратной регуляции: когда собак кормили пищей с высоким содержанием холестерина, синтез холестерина в организме угнетался. Может быть, предположили двое врачей, у пациентов с семейной гиперхолестеринемией нарушена обратная регуляция холестерина?
Тогда как большинство их талантливых сокурсников планировали сделать исследовательскую карьеру в онкологии, нейрофизиологии и других престижных дисциплинах, Голдштейн и Браун решили работать вместе и всерьез заняться изучением регуляции холестерина. «Это просто жирные капельки», – подначивали их приятели. Но Голдштейн и Браун игнорировали такие насмешки и, перебравшись в Юго-Западный медицинский центр при Университете Техаса, официально объединили свои лаборатории. Всего через два года, работая без выходных, они смогли приоткрыть тайну холестеринемии и понять логику регуляции холестерина, поставив ряд изящных экспериментов.
К тому моменту, как они начали свою работу, уже был расшифрован биохимический «путь», приводивший к образованию молекулы холестерина, содержавшей 27 атомов углерода, из молекул предшественника, в которых было всего по два атома углерода. Это достижение стало результатом серии открытий, за которые было присуждено в общей сложности 11 Нобелевских премий. Биохимический «путь» включал в себя около 30 ферментов, но было известно, что активность синтеза холестерина определяется на первом этапе «пути», где образуется вещество с длинным названием: 3-гидрокси-3-метилглютарил-кофермент А редуктаза. Я буду называть его просто редуктазой, так как это единственный фермент, о котором пойдет речь в этой главе, и в данном случае несущественно, как именно он работает. В данном случае, как и в предыдущем, важна сама логика регуляции.
Брауну и Голдштейну требовалось изучить активность редуктазы у человека, но, поскольку этот фермент действует в печени, поставить такие опыты на людях было бы сложно. Тогда они разработали способ наблюдения за ферментом в клеточных культурах, взятых у человека и выращиваемых в пробирке. Чтобы клетки росли в культуре, им требуются питательные вещества, обычно предоставляемые в виде сыворотки. Один из первых феноменов, открытых Брауном и Голдштейном, заключался в следующем: активность редуктазы подвергалась отрицательной регуляции со стороны какого-либо компонента сыворотки; в присутствии сыворотки активность снижалась, а при отсутствии сыворотки – десятикратно возрастала.
Тогда они захотели выяснить, какой компонент сыворотки подавляет активность редуктазы. Они полагали, что все дело в каком-нибудь липидосодержащем веществе, поэтому проверили активность ЛПНП (липопротеина низкой плотности), ЛВП (липопротеина высокой плотности) и фракций, не содержащих липидов. Оказалось, что именно ЛПНП, но не ЛВП и не другие фракции был мощным ингибитором активности фермента.
Исходя из логики и открытий Моно и Жакоба, Голдштейн и Браун предположили, что у пациентов с гиперхолестеринемией, страдавших избытком холестерина, могли возникать мутации в гене редуктазы, из-за которых этот фермент не поддавался регуляции со стороны ЛПНП. Первая серия экспериментов, казалось бы, подкрепляла эту версию. Когда клетки пациентов с семейной гиперхолестеринемией выращивались в культурах, Голдштейн и Браун отмечали, что активность редуктазы в этих клетках в 40–60 раз выше, чем в клетках здоровых людей, и что ЛПНП не влияет на активность фермента в них.
Но следующий эксперимент позволил отмести идею о том, что у пациентов с семейной гиперхолестеринемией изменяется редуктаза как таковая, зато подсказал иную возможность. ЛПНП – это структура, в состав которой входят и белки, и липиды, в том числе холестерин. Браун и Голдштейн предположили, что холестерин является действующим веществом, подавляющим активность фермента. Поэтому они стали «кормить» клетки холестерином, не содержавшим липопротеинов, и в результате обнаружили, что холестерин – действительно мощный ингибитор активности фермента в клетках здорового человека, но с удивлением заметили, что холестерин также снижает активность редуктазы в клетках пациентов, страдающих семейной гиперхолестеринемией. Таким образом, редуктаза у таких пациентов была не менее чувствительна к обратному контролю холестерина, чем у здоровых людей, за исключением случаев, когда холестерин присутствовал только в составе ЛПНП.
Поскольку дефект у пациентов с семейной гиперхолестеринемией был связан не с ферментом-редуктазой, причина должна была заключаться в чем-то ином, в каком-то факторе, о котором Голдштейн и Браун пока не знали. Поскольку холестеринсодержащий ЛПНП циркулирует вне клеток, возможно ли, что у пациентов с семейной гиперхолестеринемией была нарушена передача холестерина из внеклеточного ЛПНП в сами клетки?
Браун и Голдштейн предположили, что вне клеток может существовать специфический рецептор ЛПНП. Чтобы проверить эту идею, они поставили схожий эксперимент. Они снабдили частицы ЛПНП радиоактивными «метками», чтобы измерить, насколько активно они связываются с клетками. Выяснилось, что меченые частицы ЛПНП связывались именно со здоровыми клетками, но не с клетками, пораженными семейной гиперхолестеринемией. Этот эксперимент выявил специфичный рецептор ЛПНП в здоровых клетках, который, однако, отсутствовал в клетках пациентов с семейной гиперхолестеринемией. Действительно, в регуляции уровня холестерина участвовал еще какой-то фактор.
Браун и Голдштейн выяснили, как действует рецептор, доставляющий холестерин извне клеток в сами клетки. Белковая часть ЛПНП несет холестерин и пристыковывается к рецептору, затем молекулы холестерина внутри клеток отделяются от белка и, уже будучи в клетках, могут регулировать активность редуктазы. Открытие рецептора ЛПНП объясняло, почему циркулирующий ЛПНП не может регулировать синтез холестерина у больных семейной гиперхолестеринемией, а у здоровых людей – может.
Браун и Голдштейн также установили, что количество рецепторов ЛПНП на клетках подчиняется обратной регуляции так же, как и редуктаза: когда уровень холестерина в клетках низок, увеличивается количество рецепторов ЛПНП и активность редуктазы; когда уровень холестерина высок, количество рецепторов и активность редуктазы снижаются. Это абсолютно логично, поскольку клетки могут поддерживать стабильный уровень холестерина: когда уровень холестерина низок, клетки извлекают холестерин из кровотока, а также синтезируют его; когда холестерина достаточно, угнетаются как редуктаза, так и рецепторы ЛПНП.
Более 93 % всего холестерина в организме содержится в клетках, он для них жизненно важен. Но 7 % циркулирует в крови; примерно две трети от этой доли – в форме ЛПНП, треть – в форме ЛВП. Эпидемиологические исследования и опыты на животных показали, что именно циркулирующий в крови ЛПНП-холестерин («плохой холестерин») – основная причина образования бляшек и возникновения сердечных заболеваний. Можно ли было использовать в медицине открытия Голдштейна и Брауна о законах регуляции холестерина? Эти двое даже не подозревали, что семена медицинской революции уже посажены очень далеко от Техаса.
«Пенициллин» для холестерина?
Акира Эндо рос в большой семье на ферме в японской префектуре Акита. Дедушка поддерживал его интерес к медицине и естествознанию, рассказывая маленькому Акире о природе. В 10-летнем возрасте Эндо увлекался грибами и плесенью. Он узнал, что существуют грибы, смертельно опасные для мух, но не для людей. В колледже он познакомился с новаторскими работами Александра Флеминга, открывшего антибиотик пенициллин – вещество, образующееся в голубовато-зеленой плесени Penicillium.
Закончив колледж, Эндо устроился на работу в фармацевтическую компанию «Санкё» в Токио, где первое время занимался пищевыми добавками. Получив задание найти такой фермент, который позволил бы уменьшить содержание мезги в вине или сидре, Эндо исследовал более 200 штаммов плесени. Он нашел грибок-паразит, который рос на виноградинах и синтезировал нужные ферменты. После того как этот продукт стал хорошо продаваться, Эндо заинтересовался другим веществом – холестерином.
Когда эпидемиологические исследования, связывающие сердечные заболевания с высоким уровнем холестерина, получили широкую известность, Эндо, как и научные сотрудники многих фармацевтических компаний, подумал: ингибиторы синтеза холестерина могут оказаться очень важными лекарствами. Действительно, в 1960-е было разработано много препаратов, нацеленных на борьбу с повышенным холестерином, но эти лекарства в большинстве своем действовали неважно и давали тяжелые побочные эффекты. Никто не пытался использовать редуктазу.
Но у Эндо созрела оригинальная идея и был особый подход. Он хорошо знал, что плесневые грибки синтезируют всевозможные соединения, в том числе пенициллин, подавляющие рост конкурирующих с ними микробов. Он также знал, что основным стерином в клеточных мембранах некоторых грибков был не холестерин, а эргостерин. Итак, рассуждал он, возможно, некоторые грибки естественным образом выработали такое соединение, которое может ингибировать синтез холестерина в других организмах. Удастся ли найти такой «пенициллин» против холестерина?
Эндо придумал простую стратегию поиска. Он знал, что редуктаза – первый компонент в биохимическом «пути» холестерина, поэтому разработал простой анализ для выявления любого вещества, которое бы ингибировало активность фермента. Затем можно было взять выращенные в лаборатории образцы плесени и проверить, синтезирует ли какой-либо грибок ингибитор редуктазы. В апреле 1971 г. он и трое ассистентов приступили к поискам.
День за днем Эндо с коллегами выращивали и проверяли множество видов грибка – всего около 6000. Спустя два года поисков они выявили два многообещающих вида. Затем попробовали выделить активные ингредиенты соответствующих культур. Первый, полученный от грибка Pythium ultimum, оказался открытым ранее антибиотиком, который назывался «цитринин». Он ингибировал редуктазу, но, как уже установили, был очень токсичен для животных. Второе вещество, выделенное летом 1973 г., было получено от грибка Penicillium citrinum, голубовато-зеленой плесени, выросшей на рисе, приобретенном у уличного торговца в Киото. Этот грибок оказался родственным тому, из которого был получен пенициллин.
Чтобы собрать достаточное количество активного вещества для лабораторных исследований, ученые вырастили гигантскую 600-литровую емкость грибка, из которой удалось получить в общей сложности 23 мг нужного соединения – меньше обычной таблетки аспирина. Работая с этим драгоценным веществом, ученые смогли показать, что молекула, обозначенная ими ML-236B (позже названная «компактин»), является мощным ингибитором редуктазы, эффективным в малых концентрациях. Участок молекулы компактина сильно напоминал обычный субстрат редуктазы – вот почему компактин ингибировал этот фермент. Он встраивался в активный центр («замок») редуктазы – на то место, куда обычно вставал субстрат («ключ»). Таким образом, работа фермента блокировалась.
Читать бесплатно другие книги:
