Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований Сбойчаков Виктор

3.1. Метаболизм

Метаболизм представляет собой совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов: энергетического метаболизма (катаболизма) и пластического (конструктивного) метаболизма (анаболизма).

Прокариоты, как и эукариоты, в процессе ферментативных катаболических реакций выделяют энергию, которая аккумулируется в молекулах АТФ. В процессе ферментативных анаболических реакций эта энергия расходуется на синтез многочисленных макромолекул органических соединений, из которых в конечном итоге строятся биополимеры – составные части микробной клетки. Взаимосвязь анаболизма и катаболизма выражается также в том, что на определенных этапах метаболизма образуются одинаковые промежуточные продукты (амфиболиты), которые используются в обоих процессах.

Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выраженным разнообразием. В качестве питательных веществ микробные клетки используют различные органические и минеральные соединения.

3.2. Источники углерода и типы биологического окисления

В соответствии с законом сохранения энергии все функции живого организма, требующие затраты энергии, должны осуществляться за счет внешних источников энергии, которые бывают двоякого рода.

Автотрофные организмы могут синтезировать органические соединения из неорганических веществ (прежде всего из СО₂ иН₂О), используя дополнительные источники энергии. Гетеротрофные организмы используют в качестве источника энергии готовые органические «питательные вещества» и живут за счет автотрофных организмов и их биосинтетических процессов.

При распаде органических веществ химически связанная энергия освобождается (катаболизм, диссимиляция). Этот распад без участия кислорода (анаэробные условия) приводит к образованию органических продуктов, богатых энергией, таких, как органические кислоты или этанол (брожение), а при использовании кислорода (аэробные условия) – конечных продуктов: углекислого газа и воды (дыхание), бедных энергией.

Суммарные уравнения дыхания складываются из двух процессов:

1) постепенного расщепления субстрата с отнятием водорода, который связывается с коферментами;

2) постепенного окисления водорода в результате переноса его на кислород.

Расщепление углеводов происходит в результате последовательного воздействия на субстрат различных ферментов. Этот процесс начинается с гликолиза. При подготовке к расщеплению различные углеводы превращаются в фруктозо-1,6-фосфат. Гликолиз – это процесс окислительного расщепления, происходящий в цитоплазме бактерий и ведущий от фруктозо-1,6-фосфата к промежуточному продукту – пировиноградной кислоте.

При разных видах брожения дальнейшая судьба продуктов гликолиза – пировиноградной кислоты и NAD Н – различна.

При молочнокислом брожении (стрептококки, лактобациллы) водород переносится на пировиноградную кислоту и образуется молочная кислота:

При спиртовом брожении (сахаромицеты) пировиноградная кислота сначала декарбоксилируется, т. е. от нее отщепляется СО₂,азатем промежуточный продукт (ацетальдегид) восстанавливается в этиловый спирт (этанол) в результате переноса водорода:

При маслянокислом брожении (клостридии) пировиноградная кислота превращается в ацетат [C H ₃ C=0], связанный с коферментом (ацетил-СоА). Два таких остатка соединяются в ацетоацетат, который восстанавливается до н-масляной кислоты (СН₃СН₂СН₂СООН).

В 30-е годы XX века В. А. Энгельгардом, О. Варбургом, Ф. Лимпаном и Д. Диккенсаном было доказано, что кроме гликолиза в бактериальных клетках существует еще один путь расщепления углеводов – ступенчатый окислительный распад гексоз до пентоз и других сахаров с более короткой цепью. Ключевую роль в таких реакциях играют пентозофосфаты, в связи с чем этот цикл называется пентозофосфатным.

Суммарное уравнение этого цикла имеет вид:

Небольшое число микроорганизмов, к которым относятся главным образом бактерии из рода Pseudomonas, получают энергию с помощью специфического метаболического пути – Энтнера – Дудорова. Существует предположение, что он появился в связи с высокой потребностью прокариот в пировиноградной кислоте как кратчайшему пути ее образования (всего 4 реакции, тогда как при гликолизе она образуется после 9 реакций).

В аэробных условиях пировиноградная кислота (ПВК) подвергается окислительному декарбоксилированию в цикле трикарбоновых кислот до конечных продуктов: СО₂ иН₂О. Непосредственным реакциям цикла предшествует подготовительная фаза – окисление пировиноградной кислоты до ацетилкоэнзима А (ацетил = СоА):

Окислительное декарбоксилирование ПВК катализируется пируватдегидрогеназной системой. Она состоит не менее чем из трех ферментов, которые используют пять коферментов: тиамидинфосфат, амид липоевой кислоты, коэнзим А, FAD, NAD.

При аэробном окислении 1 моля глюкозы клетка получает 38 молей АТФ, тогда как при гликолизе только два.

В цикле трикарбоновых кислот от субстратов отделяются протоны и электроны. Они поступают на коферменты NAD⁺ и FAD⁺, которые передают их в дыхательную цепь, образованную окислительно-восстановительными ферментами, находящимися на плазматической мембране у прокариот и на внутренней мембране митохондрий у эукариот. Передвигаясь от одного переносчика электронов к другому, электроны опускаются на все более низкие энергетические уровни, отдавая порциями свою энергию. В последнем звене цепи они восстанавливают молекулярный кислород. Освобожденная при переносе электронов по дыхательной цепи энергия запасается в фосфатных связях АТФ. Окислительно-восстановительные ферменты представлены дегидрогеназами, флавопротеидами, цитохромами, а также убихиноном и белками, содержащими железо и серу.

Автотрофный метаболизм осуществляется бактериями путем фотосинтеза и хемосинтеза. Для облигатных автотрофов фотосинтез – единственный источник энергии: у них нет процессов диссимиляции, поставляющих АТФ. Фотосинтез состоит из двух фаз: световой и темновой. Световой процесс можно представить так:

Во время темновой фазы атомы водорода, поставляемые световыми реакциями, используются для восстановления СО₂ до углеводов согласно общему уравнению фотосинтеза:

При этом на каждый моль синтезированного углевода запасается около 160 кДж энергии.

Русским микробиологом С. Н. Виноградским было показано, что хемосинтезирующие бактерии получают энергию при окислении неорганических соединений:

Хемосинтез (в отличие от фотосинтеза) – облигатно аэробный процесс.

При аэробном (кислородном) дыхании конечным акцептором электронов служит кислород, а при анаэробном (бескислородном) – неорганические соединения. Исходя из этого, по типу дыхания выделяют следующие группы бактерий:

– строгие (облигатные) аэробы, которые размножаются только в присутствии кислорода, например псевдомонады;

– микроаэрофилы, которым требуется меньшее количество кислорода, например кампилобактеры;

– факультативные анаэробы, которые могут размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях, например энтеробактерии;

– строгие (облигатные) анаэробы, которые размножаются только в бескислородных условиях, например бактероиды.

Отдельно следует выделить аэротолерантные бактерии, которые способны расти в присутствии кислорода, но они не используют этот кислород в качестве источника энергии, а получают энергию при брожении, например молочнокислые бактерии.

Токсическое действие кислорода на бактерии объясняется отсутствием у них ферментов каталаз и системы регуляции окислительно-восстановительного потенциала.

3.3. Источники азота

Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов) микроорганизмы нуждаются в доступном источнике азота. Одни из них способны усваивать молекулярный азот из атмосферы (азотфиксирующие бактерии), другие ассимилируют только азотсодержащие органические соединения.

Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония, называют прототрофами. В отличие от них микроорганизмы, не способные синтезировать какое-либо из жизненно необходимых соединений, называют ауксотрофами. Они ассимилируют эти и другие соединения в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина. Ауксотрофами чаще всего являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.

Кроме азота и углерода всем микроорганизмам для биосинтетических реакций необходимы соединения, содержащие фосфор, серу, а также ионы магния, калия, кальция, железа и другие микроэлементы.

Потребность того или иного микроорганизма в определенных факторах роста является стабильным признаком, который используется для дифференциации и идентификации бактерий, а также при изготовлении питательных сред для лабораторных и биотехнологических целей.

Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или иных аминокислотах (одной или нескольких), поскольку не могут их самостоятельно синтезировать: клостридии нуждаются в лейцине, тирозине; стрептококки – в лейцине, аргинине и др. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофными по тем или иным аминокислотам, которые они не способны синтезировать.

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факторами роста для разных видов стрептококков, некоторые азотистые основания нужны для роста стафилококков и других бактерий. В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм.

Липиды, в частности компоненты фосфолипидов – жирные кислоты, необходимы для роста некоторых стрептококков и микоплазм. Все виды микоплазм ауксотрофны по холестерину и другим стеринам, что отличает их от других прокариот. Эти соединения входят в состав их цитоплазматической мембраны.

Витамины, главным образом группы B, входят в состав коферментов и или их простетических групп. Многие бактерии ауксотрофны по определенным витаминам. Например, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амиде, который входит в состав NAD и NADF, стафилококки и бруцеллы – в тиамине (B₁), входящем в состав пирофосфата. Кроме того, факторами роста для многих бактерий являются фолиевая кислота, биотин, а также гемы – компоненты цитохромов. Последние необходимы гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза и др.

Метаболиты и различные ионы проникают в микробную клетку путем пассивной диффузии, облегченной диффузии, активного транспорта и при участии фосфотрансферазной системы (рис. 12). Два первых пути не требуют энергетических затрат. Облегченная диффузия протекает при участии ферментоподобных белков — пермеаз. Этими путями в клетку переносится ограниченное количество соединений. Большинство метаболитов, ионов и других веществ транспортируется в клетку активным путем с помощью специфических пермеаз, локализованных в цитоплазматической мембране. Данный процесс требует энергетических затрат и происходит даже в тех случаях, когда концентрация упомянутых соединений в среде ниже, чем в микробной клетке. При этом каждая пермеаза переносит в клетку только определенную аминокислоту или другое соединение. Фосфотрансферазная система состоит из ферментов I и Hpr, а также набора субстратов, осуществляющих фосфорилирование.

Рис. 12. Проникновение питательных веществ в бактериальную клетку:

Различная длина стрелок указывает на сдвиг равновесия. S – высокая, а s – низкая концентрация растворенных веществ; С – пермеазы; R – белок Hpr; R-ф – фосфо-Hpr; S-ф – фосфатная группа (по: Стейнер Р., 1979)

В процессе переноса может произойти химическая модификация вещества, например фосфорилирование углеводов при участии соответствующих ферментов.

Микроорганизмы синтезируют самые разнообразные ферменты (энзимы). Ферментный состав любого микроорганизма определяется его геномом и является достаточно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами бактерий, широко применяется для их идентификации. Вместе с тем многие ферменты (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств у возбудителей некоторых инфекционных заболеваний, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Одни ферменты микроорганизмов локализуются в их цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве, другие выделяются в окружающую среду. На этом основано деление ферментов на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты расщепляют макромолекулы в окружающей среде до более простых соединений, которые затем транспортируются в микробную клетку. Некоторые ферменты, локализованные в цитоплазме, функционируют независимо друг от друга, другие тесно связаны между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в определенной последовательности. Внутриклеточные ферменты, объединенные структурно и функционально, например ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране, составляют мультиферментные комплексы.

Ферменты, которые постоянно синтезируются в микробных клетках в определенных концентрациях, называют конститутивными. К ним относятся ферменты гликолиза. Ферменты, концентрация которых резко возрастает при наличии соответствующего субстрата, называют индуцибельными (индукция субстратом). К ним относятся ферменты транспорта и катаболизма лактозы – галактозидпермеаза; -галактозидаза и галактозидацетилтрансфераза; фермет, разрушающий пенициллин, – -лактамаза. В отсутствие субстрата они находятся в бактериальной клетке в следовых концентрациях, а при наличии соответствующего индуктора их количество резко возрастает.

Функциональная активность ферментов и скорость ферментативных реакций зависят от условий, в которых находится данный микроорганизм, и прежде всего от температуры и pH среды. Для многих патогенных микроорганизмов оптимальными являются температура 37 °C и pH 7,2 – 7,4.

3.4. Биосинтез углеводов, аминокислот и липидов

Микроорганизмы синтезируют моно-, олиго-, полисахариды и другие соединения, в состав которых входят углеводы. Автотрофы синтезируют глюкозу из углекислого газа (CO₂) атмосферного воздуха. Гетеротрофы синтезируют глюкозу из углеродсодержащих соединений с длиной цепи C₂– C₃. В обоих случаях используются в основном реакции гликолиза, идущие в обратном направлении.

Большинство прокариот способны синтезировать все аминокислоты из пирувата. Источниками энергии являются молекулы АТФ. При образовании аминокислот азот вводится в молекулу предшественника на последних этапах биосинтеза при помощи реакций аминирования и переаминирования. Переход неорганического азота в органический происходит через ионы аммония, которые включаются в состав органических соединений. Только несколько аминокислот (L-аланин, аспартат и L-глутамат) образуются путем прямого аминирования, остальные – путем переаминирования.

Вместе с тем многие микроорганизмы могут получать аминокислоты из молекул белка, которые предварительно расщепляются ими с помощью протеаз и пептидаз. Образовавшиеся олигопептиды и аминокислоты переносятся в микробные клетки, где включаются в метаболические пути биосинтеза или подвергаются дальнейшему расщеплению. Ауксотрофные по некоторым аминокислотам прокариоты (ряд патогенных бактерий, микоплазмы, спирохеты) потребляют их в готовом виде в организме хозяина.

Липиды микроорганизмов представлены жирными кислотами, фосфолипидами, воском, терпенами, каротиноидами, которые содержат длинноцепочечные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты.

Важную роль в биосинтезе жирных кислот у микроорганизмов играют так называемые ацилпереносящие белки. В ходе биосинтеза к ним присоединяются ацильные фрагменты с образованием тиоэфиров. Последовательное удлинение этих фрагментов приводит в конечном итоге к образованию высших жирных кислот, содержащих обычно 16 – 18 углеродных атомов.

Многие микроорганизмы синтезируют ненасыщенные жирные кислоты с двойными связями, которые формируются из соответствующих насыщенных кислот. У аэробов этот процесс требует присутствия кислорода. Микоплазмы получают жирные кислоты в готовом виде из клеток хозяина или из питательной среды.

Центральную роль в биосинтезе фосфолипидов играет цитидинфосфатглицерид, являющийся непосредственным предшественником фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита и фосфатидилглицерофосфата. Остальные фосфолипиды образуются путем ферментативных превращений этих соединений.

3.5. Рост и размножение микроорганизмов

Для роста и размножения микроорганизмов необходимы минеральные соединения, содержащие катионыNH⁺₄,K⁺,Mg²⁺ и др. Ионы аммония используются некоторыми бактериями для синтеза аминокислот, ионы калия – для связывания тРНК с рибосомами. Благодаря значительной внутриклеточной концентрации ионов калия в бактериальных клетках поддерживается высокое осмотическое давление. Ионы магния выполняют роль кофактора в ряде ферментативных процессов. Ионы трехвалентного железа входят в состав цитохромов и других гемопротеидов. Для ряда патогенных и условно-патогенных бактерий (эшерихии, шигеллы и др.) потребление трехвалентного железа в организме хозяина затруднено из-за нерастворимости его соединений при нейтральных и слабощелочных значениях pH. Некоторые микроорганизмы вырабатывают особые вещества — сидерофоры, которые связывают трехвалентное железо и делают его соединения растворимыми и транспортабельными. Бактерии активно ассимилируют анионы SO ₄^2– иPO ₄^3– для синтеза соединений, содержащих эти элементы (серосодержащие аминокислоты, фосфолипиды и др.).

Под термином рост следует понимать необратимое увеличение массы и размеров тела живых существ, для бактерий – увеличение количества клеток и клеточной массы.

Бактерии обычно размножаются бесполым путем – делением. Из одной клетки образуются две, каждая из которых делится в свою очередь. Такое деление при благоприятных условиях может продолжаться бесконечно долго. Вначале делится нуклеоид, затем между двумя будущими клетками образуется перегородка, состоящая из двух слоев цитоплазматической мембраны. Затем между этими двумя слоями появляется материал, из которого образуются два слоя клеточной оболочки. После расслоения клеточных оболочек клетки расходятся.

Грамположительные бактерии делятся посредством образования перегородки, вырастающей от клеточной стенки к центру. У микобактерий перегородка образуется внутри клетки, затем расщепляется на два слоя и разделяет клетку на две. Грамотрицательные бактерии, как правило, истончаются в центре и разделяются перегородкой на две клетки.

Скорость размножения микроорганизмов зависит от состава среды, температуры, условий питания, влажности и ряда других факторов. При благоприятных условиях многие бактерии делятся через 20 – 30 мин.

Недостаток пищи и накопление продуктов распада ограничивают скорость размножения. В проточной среде с непрерывно обновляющимся составом бактерии могут делиться каждые 15 мин. Скорость размножения различных видов бактерий неодинакова даже при наличии тождественных условий. Процесс размножения бактерий в свежей питательной среде включает в себя несколько этапов. Стационарная фаза – период задержки размножения. В этот период, который длится 1 – 2 ч, бактерии, внесенные в свежую питательную среду, не размножаются. Лаг-фаза – приспособление бактерий к новой среде и к последующему размножению в ней. К концу лаг-фазы объем клеток увеличивается. Длительность лаг-фазы зависит как от внешних условий, так и от возраста бактерий и их видовой специфичности. Лаг-фаза развития – время интенсивного логарифмического или экспоненциального размножения. В данный период размножение бактерий идет с максимальной скоростью, а число клеток увеличивается в геометрической прогрессии.

За этими фазами наступает стадия, характеризующаяся постепенным уменьшением количества жизнеспособных бактерий вследствие истощения источников энергии, накопления продуктов метаболизма и других факторов.

Культура бактерий в ограниченном объеме питательной среды называется периодической, и описанные фазы роста характерны именно для таких культур. Если благоприятные для роста бактерий условия поддерживать путем подачи свежей питательной среды и оттока продуктов распада, то их культивирование станет непрерывным. Это происходит при различных биотехнологических процессах.

По типу дыхания риккетсии являются аэробами. Их характерными метаболическими признаками являются: полное окисление глутаминовой кислоты и отсутствие утилизации глюкозы. Риккетсии имеют белковые эндотоксины, чувствительные к формалину.

Рис. 13. Колонии микоплазм

Риккетсии размножаются путем обычного деления кокковидных и палочковидных форм с последующей фазой гомогенных популяций. Другой формой размножения является мицеллярное (как у грибов) дробление нитевидных форм. Нитевидные формы соответствуют наиболее ранней фазе развития риккетсий, а кокковидные и короткие палочковидные формы представляют конечную стадию их деления. Риккетсии размножаются гораздо медленнее, чем бактерии.

Размножение микоплазм не может происходить без участия стерола. Хотя микоплазмы и могут расти на искусственных питательных средах, для своего роста они нуждаются также в холестерине, жирных кислотах и нативном белке. Микоплазмы проникают через водную пленку и адсорбируются агаром. Через 18 ч внутри агара формируются маленькие сферические колонии, через 48 ч эта колония достигает поверхности водной пленки агара. Внешние колонии микоплазм имеют вид яичницы-глазуньи (рис. 13).

Хламидии существуют в двух формах, различающихся по морфологическим и биологическим свойствам. Инфекционной внеклеточной формой является элементарное тельце (ЭТ), а вегетативной, репродуцирующейся, внутриклеточной – ретикулярное тельце (РТ). Элементарное тельце имеет вид сферы диаметром 0,15 – 0,2 мкм, ретикулярное – имеет структуру типичных грамотрицательных бактерий размером около 1 мкм (рис. 14). В ЭТ содержится больше дисульфидных связей, что позволяет им противостоять осмотическому давлению.

Первый этап инфекционного процесса – адсорбция ЭТ на плазмалемме клетки-хозяина. Важную роль здесь играют электростатические силы. Внедрение хламидий происходит путем эндоцитоза. Инвагинация участка плазмалеммы с адсорбированным ЭТ происходит в цитоплазму с образованием фагоцитарной вакуоли. Эта фаза занимает 7 – 10 ч, затем в течение 6 – 8 ч происходит реорганизация ЭТ в вегетативную форму – ретикулярное тельце, способное к росту и делению. Именно в этой фазе эффективно применение антибактериальных препаратов, поскольку ЭТ к ним не чувствительно.

Рис. 14. Цикл размножения хламидий (стадии развития от попадания ЭТ в клетку до выхода ЭТ следующего поколения):

1 – адсорбция элементарного тельца; 2 – проникновение элементарного тельца в клетку; 3 – реорганизация элементарного тельца в ретикулярное тельце; 4 – деление ретикулярного тельца; 5 – созревание ретикулярных телец в элементарные; 6 – накопление ретикулярных телец в эндосоме; 7 – выход хламидий из клетки

Размножение хламидий приводит к формированию включений, известных под названием телец Провачека. В течение 18 – 24 ч развития они локализованы в цитоплазматическом пузырьке, образованном из мембраны клетки-хозяина. Во включении может содержаться от 100 до 500 хламидий. Остановка процесса на этой стадии ведет к персистенции хламидийной инфекции. Далее начинается процесс созревания ретикулярных телец через переходные (промежуточные) тельца в течение 36 – 42 ч развития в ЭТ следующего поколения. Полный цикл репродукции хламидий равен 48 – 72 ч и завершается разрушением пораженной клетки. В случае возникновения для хламидий неблагоприятных метаболических условий этот процесс может затягиваться на более длительный период.

Хламидии могут высвобождаться из инфицированной клетки через узкий ободок цитоплазмы. При этом клетка может сохранять жизнеспособность, этим можно объяснить бессимптомность течения хламидийной инфекции.

Рис. 15. Артроспоры культуры гриба Trichosporon beigelii

Грибы размножаются как половым, так и бесполым (вегетативным) способом. Последний осуществляется с помощью простого митоза. Основные способы размножения:

1) фрагментация гифов мицелия грибов, в результате чего образуются артроспоры (рис. 15); если они образуют толстостенную оболочку, то называются хламидоспорами, высокоустойчивы к действию неблагоприятных факторов внешней среды;

2) почкование, в результате которого образуются бластоспоры;

3) образование бесполых спор, которое у одних грибов происходит в специальных вместилищах (спорангиях) — спорангиоспоры (эндоспоры); у других – на специализированных гифах-конидиеносцах — экзоспоры, или конидии (рис. 16).

Число, форма и размер конидий имеют особую организацию. Некоторые виды способны образовывать различные типы конидий – одноклеточные (микроконидии) либо многоклеточные (макроконидии). Бесполые структуры грибов называются анаморфами, а половые — телеоморфами. Последние наиболее значимы для систематики грибов. Половые стадии обнаружены у совершенных грибов, принадлежащих к классам Ascomycetes и Basidiomycetes, а также у немногочисленных представителей класса Zygomycetes. Процесс созревания половых спор у этих грибов происходит в специальных структурах: у аскоспор – в асках (сумках); у базидиоспор – на (в) плодовых телах.

У представителей класса Zygomycetes продуктом полового процесса, представляющего собой слияние коротких боковых ответвлений вегетативных гифов, являются одноклеточные образования – зигоспоры. Весь жизненный цикл несовершенных грибов (Fungi imperfecti) проходит в гаплоидной стадии. Они размножаются только бесполым путем.

Рис. 16. Морфология грибов рода Rhizopus, класс Zygomycetes

Вирусы не способны к росту и бинарному делению, их размножение тесно связано с клеткой-хозяином. Процесс взаимодействия вирусов с чувствительной клеткой называется репродукцией. Выделяют раннюю и позднюю ее фазы. Ранняя фаза включает: 1) адсорбцию вириона на чувствительной клетке; 2) проникновение в клетку (пенетрацию); 3) раздевание вириона.

Начальные процессы адсорбции имеют неспецифический характер, в их основе может лежать электрическое взаимодействие положительно и отрицательно заряженных группировок на поверхности вируса и клетки. На адсорбцию влияют также рН, буферность и температура среды. При температуре 4 °C адсорбция носит синхронный характер, с повышением температуры скорость адсорбции увеличивается, но она приобретает асинхронный характер. Дальнейшее взаимодействие клеточных рецепторов и вирусных прикрепительных белков носит специфический характер.

Вирусы используют рецепторы, предназначенные для проникновения в клетку необходимых для ее жизнедеятельности веществ: гормонов, ферментов, факторов роста, других питательных веществ. Клеточные рецепторы имеют разную химическую природу. Так, для вируса гриппа и парагриппа рецепторами являются структуры, содержащие сиаловую (нейраминовую) кислоту.

Прикрепление вириона к клеточной поверхности осуществляется следующим образом. Вначале происходит образование единичной связи прикрепительного белка с рецептором – обратимая адсорбция. В этот момент, изменяя рН среды, воздействуя ультразвуком, антителами, можно удалить вирион с поверхности клетки. Для того чтобы наступила необратимая адсорбция, должны появиться множественные связи между вирионами и клеточными рецепторами. Число молекул клеточных рецепторов, участвующих в адсорбции, может доходить до 3000.

Прикрепительные белки вирусов могут находиться в составе уникальных образований, таких, как фибры у аденовирусов. У сложно организованных вирусов эти белки входят в состав шипов на поверхности суперкапсиды, например, у вируса гриппа имеется 300 – 450 шипов гемагглютинина. Просто организованные вирусы содержат прикрепительные белки в составе капсида.

Проникновение (пенетрация) вирусов в клетку осуществляется за счет двух механизмов, взаимодополняющих друг друга: виропексиса (эндоцитоза) и слияния вирусной и клеточной мембраны.

Термин «виропексис», предложенный в 1948 г. Фазекасом де Сан Гро, означает, что вирион попадает в цитоплазму в результате инвагинации участка плазматической мембраны и образования вакуоли. Виропексис является частным случаем рецепторного эндоцитоза, который обеспечивает поступление в клетку аминокислот, нуклеотидов, гормонов и других веществ из межклеточной жидкости. Большинство вирусов проникает в клетку путем рецепторного эндоцитоза, некоторые вирусы – за счет механизма слияния. Функцию белка слияния у вируса гриппа выполняет малая гемагглютинирующая субъединица HA2, у вирусов парагриппа белок слияния — fusion protein (англ. fusiоn – слияние).

Раздевание вируса происходит параллельно с его проникновением. В результате раздевания освобождается внутренний компонент вируса, способный вызвать инфекционный процесс. Раздевание вириона осуществляют ферменты клетки – липазы и протеазы и сопровождается рядом характерных особенностей: вирион теряет инфекционную активность, появляется чувствительность к нуклеазам, возникает устойчивость к нейтрализующему действию антител и др. Раздевание вириона осуществляется постепенно. Так, вирус гриппа вначале теряет липопротеиновую оболочку, на втором этапе удаляется М-белок и освобождается нуклеокапсид.

Прионы присоединяются к внешней поверхности мембраны N-терминальной последовательностью и путем эндоцитоза проникают в клетку. Для накопления PrP^Sc в клетке необходим нормальный PrP^C. Животным, лишенным гена PRNP, не передается прионная инфекция, при увеличении же количества молекул белка PrP возрастает вероятность перехода какой-нибудь из них в патогенную форму. Пониженная инфекционность «чужого» приона при межвидовом заражении объясняется, по всей вероятности, сниженной способностью белка PrP^Sc передавать свое патогенное состояние белку PrP^C, несколько отличающемуся от него по первичной структуре. Белок PrP^Sc в клетке вызывает преобразование PrP^C в патологическую изоформу за счет изменения конформации с разрушением альфа-спиралей и образованием бета-тяжей, возможно, с участием пока не идентифицированного белка, который может взаимодействовать с PrP^C и стимулировать его превращение (такие белки называют шаперонами). Под влиянием одной молекулы PrP^Sc происходит трансформация одной молекулы PrP^C в ее инфекционную форму PrP^Sc, далее процесс накопления инфекционного белка носит лавинообразный характер (рис. 17). Эффективность трансформации определяется видовой гомологией PrP^C и PrP^Sc и, следовательно, снижается в условиях гетерологичной системы животное – человек.

Белок PrP^C синтезируется в эндоплазматической сети и быстро расщепляется К-протеазой, период его полураспада составляет 5 – 6 ч. Синтезированный PrP^C проходит через аппарат Гольджи на поверхность клетки и связывается с гликозилфосфатидилинозитолом. Далее он переносится вдоль аксона при помощи быстрого антероградного транспорта.

Рис. 17. Процесс накопления молекул инфекционного прионного белка

Патологический белок более устойчив к клеточным протеазам и избегает клеточного метаболизма, накапливаясь в структурах лизосом и аппарата Гольджи. Повреждение лизосом вызывает аутокатализ нейрона, после гибели которого PrP^Sc заражает соседние клетки и откладывается в амилоидных бляшках. Накопление PrP^Sc всинаптических структурах и связанная с этим дезорганизация синапсов часто являются причиной развития неврологических нарушений и деменции.

Систематика занимается всесторонним описанием видов микроорганизмов, выяснением родственных отношений между ними, объединением их во взаимосвязанные и взаимоподчиненные группы (таксоны) и, в итоге, составлением естественной классификации микроорганизмов. Таксономия (от греч. taxis – расположение по порядку) является теорией систематики. Оба термина используются как равнозначные. Систематика состоит из трех частей: 1) номенклатуры (правил присвоения названий таксонам и список этих названий); 2) классификации (распределения микроорганизмов по таксономическим группам); 3) идентификации (определения вида бактерий).

Международный комитет по систематике бактерий издает «Международный кодекс номенклатуры бактерий», «Список одобренных названий бактерий» и «Дополнения» к нему.

Микробиология как наука возникла раньше, чем генетика. Поэтому систематика бактерий базировалась исключительно на изучении их фенотипических признаков. На основе методов феносистематики сформировалась традиционная классификация бактерий. Феносистематика изучает таксономические признаки микроорганизмов, т. е. любые признаки, по которым можно установить сходство и отличие классифицируемых групп микроорганизмов.

К таксономическим признакам относятся:

• морфология бактерий;

• подвижность;

• спорообразование;

• культуральные особенности;

• тинкториальные свойства (отношение к окраске по Граму);

• физиологические свойства (типы метаболизма, спектры ферментации или утилизации субстратов, отношение к кислороду);

• антигенная структура микроорганизмов;

• химический состав бактерий (жирнокислотный и липидный состав, белковые спектры и др.);

• чувствительность к бактериофагам и антибиотикам.

Вместе с тем феносистематика имеет ряд существенных недостатков:

• субъективность выбора изучаемых признаков и их оценки;

• зависимость проявления признаков от условий их изучения (фенотипическая изменчивость);

• малая информативность (фенотипически проявляется 5 – 20 % информации генома).

Для повышения информативности и объективности исследования в конце XX в. была создана численная (нумерическая) таксономия. В настоящее время она реализуется на основе компьютерных технологий и должна отвечать двум требованиям: признанию всех таксономических признаков равноценными и изучению максимально большого числа признаков.

Это позволяет применить математический подход к выявлению таксонов и устанавливать степень родства между ними по количественным показателям. Числовая таксономия применяется в научных исследованиях, а в практической работе проводят идентификацию микроорганизмов по ограниченному набору (20 – 30) ключевых таксономических признаков.

Более объективной является естественная (филогенетическая) классификация бактерий, основанная на методах геносистематики. Фенотип и генотип – неразрывные составляющие организма как целого, поэтому методы фено- и геносистематики тесно взаимосвязаны. Геносистематика изучает организацию геномов, т. е. генетические программы организмов. Объект ее исследования – ДНК клетки. Первый метод геносистематики, разработанный в 1957 г. отечественными учеными А. Н. Белозерским и А. С. Спириным и сотрудниками Института Пастера в Париже (К. Ли, Р. Вейлем, Е. Барбю), состоял в определении гуанин-цитозинового коэффициента (соотношения молярных процентов гуанина и цитозина) нуклеотидного состава суммарной ДНК микроорганизма по температуре плавления ДНК или спектрофотометрически. В настоящее время в геносистематике используются методы, позволяющие выявлять родство микроорганизмов на различных таксономических уровнях и изучать их эволюционные связи. К методам генетического анализа относятся:

1. Молекулярная гибридизация ДНК-ДНК (метод выявления гомологии ДНК) позволяет выявить родство на уровне вида и рода. При степени гомологии 70 % и более бактерий относятся к одному геновиду.

2. Молекулярная гибридизация ДНК с рибосомной РНК выявляет родство на уровне рода, семейства.

3. Секвенирование ДНК – определение нуклеотидной последовательности генов или фрагментов (олигонуклеотидов) ДНК позволяет выявлять эволюционные связи на уровне царства, отдела, класса, семейства, рода, но недостаточно чувствителен на уровне вида.

4. Рестрикционный анализ ДНК («фингерпринтинг») позволяет осуществлять внутривидовое типирование бактерий.

4.1. Классификация бактерий

Согласно «Международному кодексу номенклатуры бактерий», научным языком является латинский. Таксономические категории подразделяются на обязательные и необязательные.

Необязательные таксоны (по убывающей):

• подкласс;

• подсемейство;

• триба;

• подтриба;

• подрод;

• подвид.

Обязательные таксоны (по убывающей):

• домен;

• царство;

• тип;

• класс;

• отдел;

• порядок;

• семейство;

• род;

• вид.

Род обозначается одним словом с прописной буквы (существительным в единственном числе); вид – бинарной комбинацией, состоящей из названия рода (с прописной буквы) и видового эпитета (со строчной буквы). При первом упоминании в тексте приводится полное название вида. При повторном употреблении родовое слово сокращается до первой буквы, видовой эпитет сохраняется полностью, например Yersinia pestis и Y. pestis. Видовой эпитет дается произвольно, но чаще по происхождению вида, его особому свойству или в честь ученого, описавшего вид. Обычно видовой эпитет – существительное в родительном падеже, например Shigella sonnei.

Вид может иметь подвиды. Для их обозначения используется тройная комбинация, состоящая из названия рода, видового и подвидового эпитетов. Для разграничения видового и подвидового эпитетов перед последним ставится сокращенное слово subsp. (от лат. subspecies – подвид), например Klebsiella pneumoniae subsp. ozenae. Вид также может иметь разновидности (варианты или вары): серовары, биовары, хемовары и др., например: Salmonella enterica серовар Typhi или S. Typhi. Микроорганизмы одного вида, полученные из различных источников или в разное время, называют штаммами. Им присваивают протокольный номер или номер по источнику выделения. Термином клон обозначают культуру микроорганизмов, полученную из одной клетки. Чистая культура – это популяция микроорганизмов, состоящая из особей одного вида.

Перечень названий всех изученных (опубликованных) видов бактерий представлен в издании Международного комитета по систематике бактерий. В микробиологии до сих пор нет четкого, общепринятого определения такой важнейшей таксономической категории, как вид бактерий. Это обусловлено отсутствием надежных критериев вида у прокариотов. Критерии, используемые для определения вида у растений и животных, не пригодны для бактерий. Можно сказать, что под видом следует подразумевать условную группу микроорганизмов, одинаковых по своим фенотипическим и генотипическим свойствам.

В 1923 г. английский микробиолог Д. Берджи создал первый «Определитель бактерий». Классификация бактерий постоянно совершенствуется, что находит отражение в периодических изданиях «Определителя бактерий».

Среди клеточных форм жизни различают три домена: бактерии, архебактерии (не представляют интереса для медицинской микробиологии) и грибы-эукариоты.

В домен бактерий входят микоплазмы (бактерии, не имеющие клеточной стенки), бактерии с тонкой (грамотрицательные) и толстой (грамположительные) клеточной стенкой. Значение в патологии человека имеют только следующие типы бактерий.

Тип протеобактерий. Класс альфа-бактерий, роды Bartonella, Brucella, Ehrlichia, Orientia, Rickettsia. Класс бета-бактерий, роды Alcaligenes, Bordetella, Burkholderia, Kingella, Neisseria, Spirillum. Класс гамма-бактерий, роды Acinetobacter, Callimatobacterium, Citrobacter, Coxiella, Edwardsiella, Ervinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Francisella, Legionella, Pseudomonas, Moraxella, Vibrio, Enterobacter, Morganella, Proteus, Providentia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia, Pasteurella. Класс дельта-бактерий, род Bilophila. Класс эпсилон-бактерий, роды Campylobacter, Helicobacter, Wolinella.

Тип фирмикутов. Класс клостридий, роды Clostridium, Sarcina, Peptostreptococcus, Eubacterium, Peptococcus, Veilonella. Класс молликутов, роды Mycoplasma, Ureaplasma. Класс бацилл, роды Bacillus, Sporosarcina, Listeria, Staphylococcus, Gemella, Lactobacillus, Pediococcus, Aerococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus.

Тип актинобактерий. Класс актинобактерий, роды Actinomyces, Arcanobacterium, Mobiluncus, Micrococcus, Rothia, Stomatococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium, Bifidumbacterium, Gardnerella.

Тип хламидий. Класс хламидий, роды Chlamydia, Chlamydophila.

Тип спирохет. Класс спирохет, роды Spirochaeta, Borrelia, Treponema, Leptospira.

Тип бактероидов. Класс бактероидов, роды Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella. Класс флавобактерий, род Flavobacterium.

4.2. Классификация грибов

Классификация грибов до настоящего времени остается несовершенной и незавершенной. Ранее грибы считали организмами, ближе всех стоящими к растениям, и классифицировали как низшие растения. Основные таксоны, включающие группы грибов, назывались отделами. Большинство грибов, имеющих медицинское значение, относили к формальному отделу Fungi imperfecti. При обнаружении половой стадии развития этих грибов их относили к одному из отделов совершенных грибов (Ascomycota или Basidiomycоtа). Mногие авторы до сих пор придерживаются этой системы классификации грибов.

Достижения последних лет в области молекулярной генетики показали, что «родственные связи» между грибами установить крайне сложно. Царство Mycota объединяет две группы организмов: грибоподобные протоктисты и истинные грибы. Первая группа представлена следующими отделами: Myxomycota, Plasmadiophoromycota, Labyrinthulomycota, Oomycota, Hyphochytriomycota, Chytridiomycota. Вторая группа представлена отделами: Zygomycota, Ascomycota и Basidiomycota, а также «несовершенными грибами». К этой группе относится большинство патогенных и условно-патогенных грибов. Внутри отделов грибы, согласно классификации, разделены на классы, порядки, семейства. Грибы относятся к порядку Actinomycetales, семейству Actinomycetaceae. Отдел Zygomycota включает лишь единичных возбудителей микозов (мукороза и энтомофтороза). Представители отделов Ascomycota и Basidiomycota являются возбудителями микозов, относящихся к III и IV группам патогенности. Ряд представителей диморфных грибов, например Coccidioides immitis, относятся ко II группе патогенности, так как они способны вызывать системные заболевания человека. Такой же уровень биологической опасности имеют некоторые возбудители феогифомикоза (Cladophialophora bantiana),